酶联免疫分析技术课件

2013-8-131酶联免疫分析技术——ELISA检测免疫检验利用免疫检测原理检测与免疫相关的物质（抗原、抗体、补体、细胞因子等）

免疫检验技术

1.酶联免疫分析技术

2.放射免疫分析技术 3.荧光免疫分析技术 4.化学发光免疫分析技术 5.金标免疫分析技术 6.免疫印迹技术 7.免疫电泳技术等酶联免疫吸附试验

(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)利用免疫检测原理检测体液中的微量 物质（激素、酶、血浆中的微量蛋白、 药物浓度等） 这些检测结果为临床上确定诊断， 分析病情，调整治疗方案和判断预后 提供有效的实验依据。酶联免疫分析技术

是以酶标记抗原/抗体为主要试剂的 一种标记免疫分析技术，利用酶催化 底物反应的生物放大作用，提高特异 性抗原抗体免疫学反应检测的敏感性.历史

1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。AbAg和Ab分离，然后测定AbAg或Ab的量，2013-8-13酶联免疫吸附实验的原理

以待测抗原（或抗体）与酶标抗体（或抗原）的特异结合反应为基础，通过酶活力测定来确定抗原（或抗体）含量。 因为结合了免疫反应和酶催化反应，所以是一种特异而又敏感的技术。酶免疫技术Ab*+AgAb*Ag+Ab*

异相法：

****从而推算出Ag量。Ag*过量Ab*Ab

A g*Ab

均相法：Ab*Ag中的标记物*失去特性，直接测定游离 Ab*的量，从而推算出Ag量。Ag*过量Ab*Ab

A g*Ab1特异性

抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。 测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。

22最适比例2013-8-133敏感性化学比色法的敏感度为mg/ml水平酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。特点灵敏度高特异性强准确性好试剂稳定方法简便

酶联免疫吸附实验方法类型：

酶联免疫吸附实验的

分类双抗体夹心法（三明志法）原理固相支持物表面

3包被抗体标记抗体待测物底物一步法ELISA反应会出现钩状效应1.双抗体夹心法（主要用于测抗原）2.间接法（主要用于测抗体）3.竞争法（主要用于测小分子抗原/半抗原和抗体）4.捕获法（主要用于测血清中某抗体的亚型）

钩状效应（hookeffect）

一般情况下的双抗 体夹心法ELISA反应

抗原过量时酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐橘红色黄色棕色兰色蓝绿色492460449425642碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色红色400500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光黄色360,4504202013-8-13酶及底物HRP的底物DH2+H2O2D+2H2O

上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS。

OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后 ，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方 便，是HRP结合物最常用的底物。ETMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(ureaperoxide)。

洗涤液

常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。 液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。

5AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。

酶反应终止液2013-8-13

对照设定

阳性对照品(positivecontrol)和阴性对照品(negativecontrol)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏感度相称；在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAg检测

参考标准品

定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中.酶免疫测定操作中的注意事项的阴性对照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是阴性。

酶免疫测定操作中的注意事项试剂准备加样温育洗板显色比色结果判断结果报告及解释

标本的采取和保存标本为血浆和血清均可，血清标本应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色，出现假阳性反应。血清标本宜在新鲜时检测。 如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。 如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。 反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。

6试剂的准备

从冰箱中取出的试验用试剂应待温度 与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不 需用的部分应及时放回冰箱保存。同时应 将相应的质控取出待温度达到与室温平衡。 注意：检验人员应经常核对试剂说明 书的具体内容，能够及时发现实验操作程 序的更改和标准曲线指控定值的更新。 所用蒸馏水或去离子水应保证质量。2013-8-137

保温

ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固 相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔 中的标本和酶标记抗体，其中的抗原并不是都有均等 的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液 中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程， 因此需经扩散才能达到反应的终点。这就是为什么 ELISA反应总是需要一定时间的温育。温育温育所需时间与温度成反比，即温育温度高，则所需时间相对较短。“边缘效应”的排除:使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。

保温

温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃ （冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度， 也是大多数抗原抗体结合的合适温度。 保温的方式一般均采用水浴，可将ELISA板置于 水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。 为避免蒸发，板上应加盖。另外保温的方式还有 ELISA仪器附有特制的电热块 反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅 速平衡。 室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在 规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，应注意 温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点， 一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。

加样ELISA中一般有3次加样步聚：即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸头，以免发生交叉污染。然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证充分混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。从滴瓶中滴加试剂，除了要注意滴加角度外，滴加速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。洗涤洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。洗涤的方式：自动洗涤仪手工操作全自动加样系统的标本“交叉污染”问题

洗板每次温育后洗板是否彻底，与非特异背景显色有很大关系。洗板液一般为含0.05%Tween20的中性PBS。Tween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团。洗涤作用机理，借助其疏水基团与固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相洗板液中Tween20浓度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验测定下限。9

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质量控制（QuailityControl,Q.C）结果判断：按试剂盒所定的CUT-OFF值判断阴或阳性结果，不能以其它标准判断。Cut-off值的确立应尽可能地避免假阳性或假阴性结果的出现，即敏感性和特异性相加的值达到最大。结果报告：阴性或阳性。灰区内的结果建议患者过一段时间复查。

室内质量控制

质控品浓度的选择

S/CO2-3 或同时选择S/CO处于1.5左右的质控血清以 判断每次测定时试剂盒测定下限的有效性。 CUTOFF值计算

S/CO值计算

绘制质控图

质控图-定性

质控血清分定值和未定值两种。如只用一份质控 血清定值，一般定在正常值与异常值交界点上，定性 测定时处于弱阳性水平，称为临界值。乙肝标志物临 界值的制定，应按临床要求，为临床提供统一的判断 弱阳性的标准。 临界值质控血清可以作为试剂盒中的阳性对照品 和阴性对照品以外的第三个对照品，它可以灵敏地反 映出试剂盒的检出水平，确保弱阳性反应的标本不 漏检。

质控图-定量失控的处理及纠正2013-8-1310ELISA法检测失控纠正措施+2-2s,+1-3s分析失控原因（质控品、试剂、检测环节） 复检所有阳性样本-2-2s,-1-3s分析失控原因（质控品、试剂、检测环节）复检所有阴性样本标本因素试剂因素操作因素ELISA测定影响因素标本因素内源性干扰因素：类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、自身抗体、溶菌酶、磷脂、药物小分子、总蛋白浓度等外源性干扰因素：溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固不全、反复冻融内源性干扰因素1.类风湿因子：人血清中IgM、IgA型类风湿因子（rheu-matoidfactor,RF）可以与ELISA系统中的捕获抗体及酶标志二抗体的Fc段直接结合，从而导致假阳性。2.补体：ELISA系统中一抗和标记二抗过程中，抗体分子发生变构，其Fc段的CIq分子结合点被暴露出来，使Ciq可以将二者连接起来，从而造成假阳性。解决的办法是：（1）用1.5％乙二胺四乙酸二钾盐（EDTA）稀释标本；（2）用530C10min加热血清使Ciq灭活。3.嗜异性抗体：人类血清中含天然嗜异性抗体，该抗体将ELISA系统中一抗和标记二抗二者连接起来，也可导致假阳性。4.嗜靶抗原的自身抗体：抗甲状腺球旦白、抗胰导素抗体等嗜靶抗原的自身抗体，有时能与靶抗原结合形成抗原-抗体复合物，在ELISA测定方法中均可干扰抗原-抗体测定结果。

内源性干扰因素5.医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体：临床开展的用医源性CD3等单克隆抗体，用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等技术，均可使这些患者产生抗体这些患者在ELISA测定时均可产生假阳性。6.病毒变异：病毒变异所致的假阴性主要表现在HB-sAg的检测，HBV的S基因负责编码表达表面抗原，即S旦白，任何影响S旦白表达水平或抗原性的突变，都可能导致表面抗原检测出阴性结果。7.标本中其它成分的影响：血清脂质过高、胆红素、血红蛋白及血液黏度过大等，均对ELISA结果有干扰作用。

外源性干扰因素1.标本溶血：由于各种人为因素引起的标本溶血，均可因红细胞破坏时释放 大量过氧化物酶活性的血红蛋白，在以辣根过氧化酶为标记的ELISA测定 方法中，会导致非特异性显色，而干扰测定结果。2.标本受细菌污染：因菌体中可能含有内源性辣根过氧化酶，因此，被细菌 污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色，而干扰测定结果。

血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌 操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在－70℃以下3.标本保存不当：在冰箱中保存过久的标本，血清IgG可聚合成多聚体，在 间接法ELISA测定中会导致本底过深，甚至造成假阳性；标本放置时间过 长，有时抗原或抗体免疫活性减弱，亦可出现假阴性。为克服上述干扰， ELISA标本宜为新鲜采集，如不能测定，5天内测定的可放40C冰箱，1 周后测定的应放低温保存，冻存后溶解的标本，蛋白局部浓缩，分布不均， 应充分混均后再测定，但混均时应轻柔，不可剧烈振荡。2013-8-1311外源性干扰因素4.血液采集后，如收集管中无促凝剂和抗凝剂，则血液通常 在半小时后开始凝固，18~24h完全凝固。日常检验中，常 在血液还未开始凝固时即离心分离血清，此时因血液没有 完全凝固，离出的“血清”并非为完全的血清，其中仍残 留部分纤维蛋白原，如将其加入微