脑心同治理论与丹红注射液研究万海同

脑心同治理论与丹红注射液对脑缺血性损伤保护机制研究

浙江中医药大学万海同教授当前1页，总共71页。

万海同二级教授首席教授博导所长院长

国家百千万人才工程专家享受国务院政府津贴人员国家中医药管理局“十二五”重点学科（中医工程学）带头人国家中医药管理局中医临床基础重点学科带头人浙江省高校脑血管病创新团队负责人浙江省中西医结合学会脑心同治专业委员会主任委员浙江省中西医结合脑病重点学科负责人浙江中医药大学心脑血管疾病研究所所长浙江中医药大学生物工程学院院长浙江省中医药重点学科（中药药物代谢动力学）带头人中华中医药学会中药制剂分会副主任

当前2页，总共71页。主要内容三丹红注射液对脑缺血性损伤保护机制研究二脑心同治理论一心脑血管疾病的防治现状当前3页，总共71页。

第一部分心脑血管疾病的防治现状当前4页，总共71页。一、心脑血管病是一复杂、难治性疾病，对人类危害严重防治脑病已成为社会和医学界广泛关注的重要课题死亡率居高不下世界范围：死于心脑血管病1500万人/年；

占全球死亡人数的三分之一至二分之一；

是危害人类最大疾病。

中国：死于心脑血管病每天有7000人，每12秒钟就有1人；首次发年龄，30%以上在60岁之前。

当前5页，总共71页。我国心脑血管疾病患者已经超过2.7亿人！

我国每年死于心脑血管疾病300万人！幸存下来的患者：75%不同程度丧失劳动能力；50%以上的脑血管意外幸存者生活不能完全自理；40%重残。我国脑中风病人出院后第一年的复发率是30%，第五年的复发率高达59%；而二级预防做得较好的美国仅为10%。当前6页，总共71页。各种危险因素居高不下中国目前总共有：1.6亿高血压患者；6000万糖尿病患者；1.6亿人群血脂异常；2亿人体重超标；6000万人肥胖；还有大量烟民、酒客更令人忧虑：城乡差别不大；中年人与老年人患病率接近；中风与心肌梗塞、心力衰竭常伴随发生。当前7页，总共71页。

二、抗血栓治疗成为西医学治疗动脉粥样硬化、冠心病、脑梗死治疗的重要基石随着心脑缺血性血管疾病发生率增加，越来越多患者需要长期应用抗血栓药物，临床常用抗凝药物为华法林，抗血栓药物多为氯吡格雷及阿司匹林等。尤其是抗血小板聚集药已成为心脑血管疾病常规治疗。当前8页，总共71页。三、西医学对脑梗死内科治疗仍是抗栓、溶栓等，有一定疗效，但也有并发症等溶栓

降纤

血栓、栓子血管堵塞缺血损伤抗血栓迅速复流脑保护减慢缺血级联反应

限制再损伤

易致出血性梗死并发症

再闭塞不足之处不能改善半暗区血供当前9页，总共71页。

抗血小板药物作用机制图偱证医学新证据表明：

抗血栓西药疗效欠佳，并认为抗血小板西药是一把双刃剑：在降低心脑血管不良事件的同时，许多抗血小板聚集西药也带来了出血并发症。抗血栓药物主要分：抗血小板聚集药、抗凝血药、溶血栓药

当前10页，总共71页。主要副作用：口服抗血栓药物引起颅内出血的发生率在9-13％，死亡率超过50％抗凝溶栓对已形成血栓无直接溶栓作用，且溶栓易致出血性梗死(脑出血6.4%-19.8%，脑死亡率50%）和再闭塞等危险阿司匹林药物抵抗率达5.5%-61%当前11页，总共71页。药物种类药物作用机制试验状况谷氨酸钠拮抗剂CGS19755竞争性NMDA拮抗剂三期无效YM-872AMPA受体拮抗剂三期无效ApiganelNMDA通道阻滞剂三期无效镁NMDA受体拮抗剂三期无效GV150526NMDA拮抗剂三期无效电压门钙通道拮抗剂尼莫地平减少钙离子内流三期无效钾通道激动剂BMS-204352减少钙离子内流三期无效钠通道拮抗剂磷酸苯妥英降低兴奋性氨基酸释放三期无效5羟色胺能受体激动剂Repinotan三期无效伽马氨基丁酸激动剂氯美噻唑降低兴奋性氨基酸释放三期无效自由基清除剂替拉扎特降低自由基团的损伤三期无效依布硒啉三期无效依达拉奉三期有效NXY-059三期无效星形胶质细胞抑制剂ONO-2506三期无效一氧化氮供体硝酸甘油二期无效一氧化氮阻滞剂芦贝鲁唑减少NO介导损伤三期无效目前临床上还缺少疗效满意的西药,通常采用中西医结合的方法当前12页，总共71页。三、步长脑心通胶囊、丹红注射液等活血化瘀、或益气活血中药已广泛用于心脑血管疾病，如缺血性心脏病、缺血性中风等）及血栓性疾病等，具有较好疗效。当前13页，总共71页。

第二部分脑心同治理论当前14页，总共71页。一、脑心同治理论继承和发展了中医的整体观、辨证施治理论“天人合一”的整体观“因时因地因人”辨证施治激发人体自身抗御疾病的特点

中医药优势当前15页，总共71页。二、脑心同治理论的依据中风（脑卒中）胸痹（冠心病）气虚血瘀证证属益气活血化瘀通络治则证同治则同异病同治赵步长教授认为脑心同治理论对中风、胸痹的认识脑心同治理论的机制研究气虚、血瘀、痰浊、络阻病机益气、活血、化痰、通络治则探讨气、血、痰（及瘀）、络的相互关系现代医学实验证据《脑心同治》理论核心：

从整体观角度来诠释心脑血管病（中风、胸痹）的证属与病机、治则（一）中医角度

当前16页，总共71页。（二）中医脑心同治理论与现代医学认识的相关性

中风（脑卒中）胸痹（冠心病）气虚血瘀证证属益气活血化瘀通络治则证同治则同异病同治赵步长教授认为宏观准确性微观精确性脑心同治理论对中风胸痹认识：现代医学对心、脑血管病认识：内皮损伤血小板凝集、活化、血栓形成血浆成分通透性增强单核细胞、淋巴细胞被激活VEGF，淋巴循环泡沫细胞平滑肌细胞移行、增生脂蛋白变性纤维肌性内膜增厚胶原蛋白弹性应蛋白防御结构的障碍（HDL）异常粥样硬化灶动脉狭窄、阻塞或痉挛临床发作冠心病、脑梗塞等PDGF高脂血症、高血压、吸烟等当前17页，总共71页。动脉粥样瘢块形成及其后果瘢块开始形成稳定瘢块不稳定瘢块瘢块破裂当前18页，总共71页。当前19页，总共71页。危险因素:高血压、血脂异常糖尿病、吸烟、肥胖（中心型）动脉粥样硬化左室肥厚冠脉病变心肌缺血冠脉栓塞心肌、脑梗死心脑血管病事件链(continuum)神经体液激活心律失常心肌损失心性猝死心脏重构心室扩大心衰心脏病终末期当前20页，总共71页。无症状自然消退或增大复原功能不良短期死亡（≤28天）晚期复发（﹥28天）晚期死亡（﹥28天）疾病状态血管内粥样瘢块不断发展瘢块或血栓的表面破裂症状性缺血

猝死动脉硬化性心脑血管病自然进程

基础病变促发因素急性事件中期和晚期发展（几年至几十年）（几秒钟或几小时）（几秒钟或几小时）（几天至几年）时间顺序当前21页，总共71页。三、中医药防治心脑血管病常用药益气药：黄芪、太子参等活血化瘀药：水蛭、蜈蚣、地龙、全蝎当归、川芎、丹参、红花、

赤芍、桃仁、鸡血藤、牛膝等理气、通阳药：乳香、没药、桂枝当前22页，总共71页。配伍用药是中药复方（或方剂）发挥药效的关键，是中医处方用药的核心方剂配伍基本内容：“七情合和”与“君臣佐使”理论“君臣佐使”则表明中药配伍中药组分有主有次。主药在治病中发挥主导作用，辅药在治疗中促使主药药力得以充分发挥，同时抑制主药的毒副作用。

中医重视复方用药及其中药配伍理论当前23页，总共71页。

丹红注射液、脑心通胶囊等中药制剂相对于西药抗血小板作用机制单一，具有多组分、多靶点作用特点。意味着本品可能有更少耐药性和更少副作用。中药具有多组分、多靶点的作用特征当前24页，总共71页。四、中药目前面临的困惑“？”中药在医学科学领域的作用逐渐被国内外同行认可和关注。困惑：中药如何发挥作用？这些作用如何科学表达？中医药如何合理使用？如何达到中药清楚定位并做到“精准用药”？目前这些问题尚不十分清楚国内外同行基本一致认同是：中药作用物质基础说不清中药作用机理说不清中药（组分）相互作用说不清质量控制、安全问题说不清当前25页，总共71页。中医药应该在临床有效的基础上，更须多关注这些尚未能解决的中医药临床应用的疑难问题，以便更好地为中医临床应用服务。换言之:中医药在这些方面的问题得到解决，将会有力推动中医药学科的快速发展，也会得到国际国内同行和社会对中医药更为广泛认同的效果。当前26页，总共71页。开展了丹红注射液、脑心通胶囊发挥治疗冠心病、缺血性中风等血瘀病证的系统研究如：丹红注射液如何发挥组分相互作用，组分体内过程如何，哪些是具有生物活性的代谢产物，最终通过哪些环节、途径发挥活血化瘀效应最终实现整合调节治疗冠心病、缺血性中风等问题。当前27页，总共71页。第三部分丹红注射液对脑缺血性损伤保护机制研究1丹红注射液的主要适用病证

2丹红注射液中化学成分及代谢产物研究4丹红注射液对脑缺血性损伤的保护作用5

丹红注射液抗脑缺血性损伤的机制研究6科研项目、论文、专利情况3丹红配伍的理论依据当前28页，总共71页。一、丹红注射液的主要主要适用病证

丹红注射液（国药准字Z20026866），是临床上常用的、有效的中药制剂。是销售额最高的中药制剂之一，近年，年销售超过10亿元。具有活血化瘀、通脉舒络功效。用于瘀血闭阻所致的胸痹及中风，证见：胸痛，胸闷，心悸，口眼歪斜，言语蹇涩，肢体麻木，活动不利等症。治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞，缺血性脑病、脑血栓及肺心病所瘀诸症。当前29页，总共71页。运动是一箭多雕的成本效价比最高的预防心血管病的措施高血压高血脂糖尿病肥胖丹红注射液一箭多雕预防心脑血管病机理？脑梗死冠心病当前30页，总共71页。丹红注射液（国药准字Z20026866），为临床上常用的、有效的中药制剂。是销售额最高的中药制剂之一。丹红注射液处方用量配比:丹参750g，红花250g。二、丹红配伍的理论依据当前31页，总共71页。

丹参：味苦，性微寒，归心、肝经，功效活血化瘀、凉血消肿、宁心安神。红花：味辛，性温，归心、肝经，辛散温通，入血分，能活血祛瘀化滞、通调经脉。二药共奏活血化瘀、通经活络之功当前32页，总共71页。（一）HPLC-DAD测定丹红注射液中的有效成分6种有效成分紫外检测波长的选择

250300350400450500550600650A波长/nm6种对照品混合溶液的浓度250300350400450500550600650B波长/nm250300350400450500550600650C波长/nm吸光度（A)250300350400450500550600650D波长/nm250300350400450500550600650E波长/nm吸光度（A)250300350400450500550600650F波长/nmA.丹参素钠；B.原儿茶醛；C.咖啡酸；D.迷迭香酸；E.丹酚酸B；F.丹酚酸A

名称丹参素钠原儿茶醛咖啡酸迷迭香酸丹酚酸丹酚酸浓度（mg·mL-1）1.3100.1010.00410.1090.2193.360结果表明：丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A检测波长为280nm；咖啡酸、迷迭香酸检测波长为330nm。三、丹红注射液中化学成分及代谢产物研究当前33页，总共71页。混合对照品溶液HPLC色谱图

05101520253035401256t/minA051015202530354034Bt/min0510152025303540156t/minC051015202530354003t/minD

1.丹参素；2.原儿茶醛；3.咖啡酸；4.迷迭香酸；5.丹酚酸B；6.丹酚酸AA.对照品溶液(280nm)；B.对照品溶液(330nm)；C.供试品溶液(NO.110934280nm)；D.供试品溶液(NO.110934330nm)

色谱条件：色谱柱：EclipseXDB-C18

(4.6×150mm，5μm)

；流动相：A为乙腈，B为0.1%磷酸水溶液；柱温为30℃；流速为1.0mL•min-1.时间0~6min6~16min16~30min30~40min浓度5%A~5%A5%A~15%A15%A~26%A26%A~27%A

流动相梯度洗脱程序结果表明：该色谱条件下，样品液中6种成分与其他共存峰得到很好的分离。当前34页，总共71页。10批丹红注射液中6种成分及总黄酮含量(n=3)批号丹参素μg•mL-1原儿茶醛μg•mL-1咖啡酸μg•mL-1迷迭香酸μg•mL-1丹酚酸Bμg•mL-1丹酚酸Aμg•mL-1总黄酮μg•mL-1111050110934110928110937111042111033110858110926110927110950平均1464.981238.031391.211363.291378.931308.491346.361570.801390.561309.611376.23300.54369.17445.82345.23235.84268.05260.56412.30364.07367.06336.865.404.687.985.394.975.525.055.436.135.495.60262.17215.75236.16286.24237.06246.85163.51300.25233.68259.71244.13573.65270.41297.53396.47517.43441.90305.84399.65310.21402.57391.574650.414220.464067.065634.775083.914458.793845.145083.644711.884851.214660.72101971047092771162896869839958311799104181166310456丹红注射液样品中有效成分含量的HPLC-DAD测定丹红注射液中6种成分的含量结果表明：色谱条件下，样品液6种成分中丹酚酸A含量最高，咖啡酸含量最低，含量高低依次是丹酚酸A、丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛、迷迭香酸、咖啡酸。当前35页，总共71页。（二）对7批丹红注射液进行指纹图谱检测

1.标定了28个共有峰，7批丹红注射液指纹图谱相似度均大于0.980，表明工艺较稳定、质量可控。

7批丹红注射液指纹图谱与对照指纹图谱当前36页，总共71页。2.7批血浆、脑、肝脏组织样品特征图谱相似度均在0.92以上，说明特征指纹图谱相对稳定、准确，可用于体内成分定性分析

7批丹红注射液15min血液中指纹图谱对照指纹图谱

7批丹红注射液60min脑中指纹图谱对照指纹图谱7批丹红注射液60min肝中指纹图谱对照指纹图谱当前37页，总共71页。3.LC-MS（QTrap4500）质谱分析丹红注射液成分及其体内代谢物当前38页，总共71页。4.EMS-IDA-EPI扫描模式：所有色谱峰可扫描到EPI谱图，EMS展示107个扫描到最高峰化合物丹红注射液主要有效成分列表当前39页，总共71页。丹参素提取离子流图(XIC,m/z197)及MS2

通过丹参素特征碎片离子m/z179扫描可以找到结构类似物当前40页，总共71页。原儿茶醛提取离子流图(XIC,m/z137)及MS2

羟基红花黄色素A提取离子流图(XIC,m/z611→491)及MS2

当前41页，总共71页。丹酚酸B提取离子流图(XIC,m/z717)及MS2

MS3扫描：丹酚酸A：RT10.4min，判断二级碎片来源，比如二级碎片m/z159及m/z185来源小结：丹红注射液中有效成分主要是水溶性的酚酸类组分，极性较大。当前42页，总共71页。5.丹红注射液代谢产物分析丹红注射液中水溶性酚酸类有效成分较多，极性较大；体内I相代谢反应，通过氧化、

还原、水解等途径引入极性，使原药极性增大，利于排泄。主要以丹参素，迷迭香酸，原儿茶醛，原儿茶酸为目标组分，寻找相应代谢物.，丹红注射液代谢产物列表丹参素(Danshensu,DSS)代谢物提取离子流图及二级质谱当前43页，总共71页。原儿茶酸(Protocatechuicacid,DBA)代谢物提取离子流图及二级质谱原儿茶醛(Protocaterchuicaldehyde,PA)代谢物提取离子流图及二级质谱当前44页，总共71页。迷迭香酸(Rosmarinicacid,RA)代谢物提取离子流图及二级质谱特征II相代谢物含量随给药时间变化的趋势(Area：MRM)小结：EMS-IDA-EPI，MRM-IDA-EPI,Pre/NL-IDA-EPI等多种扫描模式结合，发现注射液中含量较高的有效成分丹参素，原儿茶酸，原儿茶醛，迷迭香酸的II相代谢物，主要是甲基化，硫酸化，甲基化后硫酸化，葡萄糖醛酸化等一系列代谢物。各时间点代谢样品中丹参素与迷迭香酸原形在代谢样品未检测到，仅检测到代谢物。初步鉴定丹红注射液中有效成分32个，同时鉴定了主要有效成分的代谢产物。当前45页，总共71页。CombinationsParametersCom1Com2Com3Com4Com5Com6Com7Com8Com9Emax(U/ml)0.7310.6430.4750.4780.7550.70.6920.7420.701EC50(μg/ml)0.1551.4230.310.120.280.4526.羟基红花黄色素A与MDA相关的药效动力学参数9个组方时间-羟A药物浓度-MDA三维动态模型当前46页，总共71页。（1）丹红注射液对神经功能缺损症状的影响

四、丹红注射液对脑缺血性损伤的保护作用Day0Day3Day7Day10Day14

Neurologicalassessment

Neurologicalassessment

Neurologicalassessment

Neurologicalassessment

MCAO

大脑中动脉栓塞模型（MCAO）示意图

在MCAO模型再灌之后的1d、3d、7d、10d和14d进行神经功能评分:1.自主活动(0-3)2.四肢运动的对称性(0-3)3.前肢外伸(0-3)4.爬动(1-3)5.身体触觉(1-3)6.震动觉(1-3)

其中3分最差，18分正常

Garciaetal.Stroke,1995.26(4):627-634

Day1Day3Day7Day10Day14

Neurologicalassessment

Neurologicalassessment

Neurologicalassessment

Neurologicalassessment

Neurologicalassessment

当前47页，总共71页。注：*P<0.01vsSham，ΔP<0.05vsIRU，#P<0.01vsDHI-1各组在大鼠脑缺血后不同时间点的神经功能缺损评分变化曲线11当前48页，总共71页。（2）丹红注射液对大鼠脑缺血后脑梗死体积的影响A假手术组B模型组C丹红注射液0.5ml/kgD丹红注射液1.0ml/kgE丹红注射液2.0ml/kgMCAO法制作大脑中动脉局灶性栓死模型

丹红注射液对大鼠脑缺血后脑梗死体积的影响组别剂量（ml/kg）n总梗死体积（mm3）假手术组NS1000模型组NS10213.572.4*丹红低剂量组0.510152.753.8#丹红中剂量组1.010116.547.6##▲丹红高剂量组2.010103.254.2##▲注：*P<0.05，**P<0.01,与对照组比较，F检验；#P<0.05,##P<0.01，与模型组比较，F检验。▲P<0.05，与低剂量组比较，F检验。

丹红注射液对大鼠脑缺血后脑梗死的影响结果可见：丹红注射液可使梗死总体积减少,与模型组相比具有显著性差异。当前49页，总共71页。五、丹红注射液抗脑缺血性损伤的机制研究自由基过度形成炎症反应纤溶系统受损兴奋性氨基酸毒性细胞凋亡神经系统损伤当前50页，总共71页。（1）丹红注射液对脑缺血再灌注大鼠脑皮质SOD活力和MDA含量影响

丹红注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠脑皮质SOD活力和MDA含量的影响(X±SD)组别剂量（ml/kg）nSOD（NU/mg）MDA（nmol/mg.）假手术组NS10541.8±48.5411.6±36.5模型组NS10272.4±35.1*947.2±86.4*丹红低剂量组0.510312.2±42.21858.3±93.9丹红中剂量组1.010364.5±45.89#782.3±95.4丹红高剂量组2.010397.1±50.61#689.3±95.4#▲注：*P<0.05，**P<0.01,与对照组比较，F检验；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较，F检验；▲P<0.05，与低剂量组组比较，F检验。

丹红注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠脑皮质SOD活力的影响丹红注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠脑皮质MDA含量的影响结果表明：（1）脑缺血再灌注组与假手术组相比，SOD活力、MDA含量均具有显著差异。（2）丹红注射液可显著提高脑缺血再灌注损伤大鼠脑皮质SOD活力，高剂量组显著降低脑缺血再灌注大鼠脑皮质MDA含量。当前51页，总共71页。（2）丹红注射液对脑缺血再灌注大鼠脑皮质6-Keto-PGFlα含量的影响

丹红注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠脑6-Keto-PGFlα含量的影响(X±SD)组别剂量（ml/kg）n6-Keto-PGFlα假手术组NS1086.31±8.31模型组NS1034.07±5.23*丹红低剂量组0.51051.11±6.81#丹红中剂量组1.01059.23±7.83##丹红高剂量组2.010

65.36±7.52##▲注：*P<0.05，**P<0.01,与对照组比较，F检验；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较，F检验；▲P<0.05，与低剂量组组比较，F检验。结果表明：（1）脑缺血再灌注组与假手术组相比具有显著差异；（2）丹红注射液各组能显著提高脑缺血再灌注损伤大鼠脑皮质6-Keto-PGF1α的含量；（3）丹红注射液中、高剂量与低剂量相比具有显著差异。

丹红注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠脑6-Keto-PGFlα含量的影响当前52页，总共71页。（3）丹红注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠血浆t-PA活性和PAI活性的影响

丹红注射液对脑缺血再灌注大鼠血浆t-PA活性和PAI活性的影响(X±SD)组别剂量（ml/kg）nt-PA（IU/ml）PAI（IU/ml）PAI/t-PA假手术组NS100.912±0.0730.652±0.0490.715模型组NS100.511±0.079*0.921±0.065*1.802丹红低剂量组0.5100.632±0.072#0.891±0.0751.410丹红中剂量组1.0100.689±0.082#0.842±0.0711.222丹红高剂量组2.0100.697±0.083#0.762±0.068#1.093注：*P<0.05，**P<0.01,与对照组比较，F检验；#P<0.05，与模型组比较，F检验。

t-PA：组织型纤溶酶原激活物；PAI：纤溶酶原激活物抑制因子结果表明：（1）脑缺血再灌注组与假手术组相比均具有显著差异；（2）丹红注射液各组与脑缺血再灌注组相比，可显著提高t-PA活性，降低PAI活性，具有增强机体的纤溶功能、促进血栓溶解的作用。当前53页，总共71页。（4）丹红注射液对大鼠脑缺血再灌注后Bcl-2、Bax蛋白表达的作用

各组缺血侧大脑皮层Bcl-2、Bax免疫组化阳性细胞数组别剂量（ml/kg）nBcl-2阳性细胞数Bax阳性细胞数Bcl-2/Bax假手术组NS1055.912.73模型组NS1084.415.6*86.815.2**0.97丹红注射液1.010126.118.2#47.312.9#2.66注：*P<0.05，**P<0.01与假手术组比较；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较，F检验。

ABcl-2假手术组，BBcl-2模型组，CBcl-2丹红注射液组，DBax组，EBax-假手术组，FBax-丹红注射液组

结果表明：（1）假手术与模型组相比，模型组缺血侧大脑皮层Bcl-2免疫组化阳性反映细胞数显著增多。（2）丹红注射液组与脑缺血再灌注模型组相比Bcl-2阳性细胞数显著增多。（3）丹红注射液与模型组相比，可使Bax蛋白的表达降低。（4）丹红注射液具有显著调节Bcl-2/Bax蛋白的表达，抑制神经元凋亡，保护脑组织的作用。

当前54页，总共71页。图2微透析套管埋植123123混合对照品溶液和透析液的HPLC图注：1.天门冬氨酸；2.谷氨酸；3.γ-氨基丁酸；A.人工脑脊液溶液

B.对照品溶液；C.空白大鼠头部透析液图1大脑中动脉阻塞模型（MCAO）0100200300400500600700800900-50050100150200模型组丹红组丹红注射液对脑缺血大鼠脑海马区Asp释放的影响050100150200250300350400-50050100150200模型组

丹红注射液对脑缺血大鼠脑海马区Glu释放的影响min丹红组02000400060008000100001200014000-50050100150200模型组丹红组丹红注射液对脑缺血大鼠脑海马区GABA释放的影响（5）丹红注射液对脑部微透析液氨基酸递质释放的影响丹红注射液通过调节脑内氨基酸递质的含量，对脑缺血起到一定的保护作用。当前55页，总共71页。丹红注射液抑制炎症因子TNF-α、IL-1β的表达，丹红注射液对炎症的抑制在脑缺血后恢复的过程中起着重要的作用。

开展的部分相关研究内容（6）丹红注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织TNF-α和IL-1β炎症因子的影响丹红注射液对大鼠脑缺血后脑组织中TNF-α和IL-1β含量的影响当前56页，总共71页。（7）丹红注射液对大鼠大脑缺血后葡萄糖代谢的影响

分子影像技术能够无创监测生物体内细胞和分子水平的生化过程，尤其是18F-FDG-PET（正电子发射断层扫描技术）能够定量地无创监测葡萄糖代谢的变化，被广泛应用于脑血管病疗效的评价。当前57页，总共71页。MACODay0Day3Day7Day10Day14

PETScanPETScanPETScan

利用18F-FDG-PET来研究丹红注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用，丹红注射液组的R/N变化值在给药后7d、14d较模型组显著增加，较好地促进了梗死区葡萄糖代谢的恢复。大鼠脑部FDG-PET横断切面的图像

R/N变化值当前58页，总共71页。

梗死区周边的GFAP（胶质纤维酸性蛋白）免疫组化染色分析图

(#P<0.01vsSham,**P<0.01vsIRU,ΔP<0.05vsDHI-1)ShamIRUDHI-2DHI-1DHI-4GFAP（200x）（8）丹红注射液对大鼠脑缺血后星形胶质细胞活化的影响

丹红注射液促使脑缺血后星形胶质细胞进一步活化，大量表达GFAP，从而促进脑缺血后神经功能的恢复。当前59页，总共71页。丹红注射液能够明显抑制缺氧诱导的脑内皮细胞早期凋亡进程和和G1/S期阻滞，且呈剂量依赖性。内皮细胞100×兔抗鼠Ⅷ因子抗体鉴定******采用原代培养的乳鼠脑微血管内皮细胞，建立缺氧损伤模型。（9）丹红注射液对乳鼠脑微血管内皮细胞缺氧损伤的保护作用正常组模型组尼莫地平组100uL/mL组50uL/mL组25uL/mL组当前60页，总共71页。

A正常组B模型组C丹红注射液100uL/mL组丹红注射液对缺氧细胞超显微结构的影响（6K×）组别C/(uL.mL−1)SOD(U/mg)MDA(nmol/mL)正常组

－85.55±3.584.09±0.50模型组

－29.35±1.04▲▲10.18±1.35▲▲丹红注射液组2533.97±4.208.80±1.00

5057.26±4.70**6.75±0.55**

10070.05±3.38**5.49±0.51**与正常组比较：▲▲P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05**P＜0.01

丹红注射液对缺氧损伤的rBMECsSOD活性和MDA水平的影响（x±s，n=6）A正常组B模型组C丹红注射液100uL/mL组当前61页，总共71页。

RT-PCR法检测P53、MMP-9、ICAM-1mRNA的表达扩增曲线图溶解曲线图扩增曲线拐点清楚，整体平行性好，基线平而无上扬现象，曲线指数期斜率与扩增效率成正比，各反应管的扩增曲线平行性好，表明扩增效率良好且相近。溶解曲线直接表示了引物的特异性，TM值基本都在80-90度之间，三个引物都出现单一峰，说明特异性扩增良好。当前62页，总共71页。

下调P53mRNA表达来抑制rBMEC早期凋亡和G1/S期阻滞；

下调ICAM-1mRNA表达介导黏附反应、促进内皮细胞迁移、降低内皮细胞活性；

下调MMP-9mRNA表达促进血管生成。以正常组为对照进行相对定量分析，丹红注射液100、50uL/mL均能明显降低MMP-9、ICAM-1、P53mRNA的表达水平。当前63页，总共71页。

桥粒连接

绒毛电镜观察（Caco-221d200×）光镜观察药物通过小肠上皮细胞转运途径示意图体外Caco-2细胞模拟体内吸收，考察丹红注射液的主要有效成分配伍在口服给药后的吸收效果。口服给药吸收

小肠生物利用度指导转运样品HPLC检测（10）丹红注射液主要有效成分配伍体外吸收特性当前64页，总共71页。R2X(cum)=0.646R2Y(cum)=0.75,Q2=0.58（R2Y和Q2大于0.5时，说明模型较好）负离子模式下血清的PLS-DA得分图(11）丹红注射液调节血脂代谢的作用

以高脂血症大鼠为模型，通过生化、分子生物学及代谢组学技术与方法，探讨丹红注射液在调节血脂代谢方面的作用机理，为其治疗脂代谢相关疾病提供科学理论依据。当前65页，总共71页。六、

科

研

项

目项目名称来源基于中西药相互作用的谷红注射液多组分药物代谢与药效相关性研究国家自然科学基金（No.81373898）基于药物相互作用的丹红注射液对脑缺血性损伤保护机制研究国家自然科学基金项目（No.81173647）丹参、川芎（参芎注射液）活性物质配伍方的多成分药物代谢动力学与对脑缺血性损伤保护作用的相关性研究国家自然科学基金项目（No.81274176）丹参红花多组分配伍方（丹红注射液为示范）药物体内过程与抗血栓效应相关性研究国家自然科学基金项目（No.81473587）基于K+/Glu激活钙信号通路的丹红注射液脑靶向活性成分筛选及神经保护机制研究浙江省自然科学基金项目（No.Y13H280035）中药（丹红配伍为例）多成分药动学与药效学相关联的方法学研究浙江省科技厅项目（No.2013C33244）当前66页，总共71页。已正式发表20余篇，待发表论文15篇HeY,WanH,DuY.etal.ProtectiveeffectofDanhonginjectiononcerebralischemia-reperfusioninjuryinrats.JournalofEthnopharmacology,2012,144(2):387-394.（SCI收录，影响因子3.014）黄翔,何昱,杨洁红,等.HPLC-DAD法与UV-VIS法对丹红注射液有效成分和有效部位的质量控制研究.中华中医药杂志,2013,04(28）（国家一级）周鹏,周惠芬,何昱,等.丹红注射液对乳鼠脑微血管内皮细胞缺氧损伤的保护作用.中草药,2013,44(19):2727-2731.（国家一级）ZefengWang,FahuanSong,JinhuiLi,etal.PETDemonstratesFunctionalRecoveryafterTreatmentbyDanhongInjectioninaRatModelofCerebralIschemic-ReperfusionInjury，Evidence-BasedComplementaryandAlternativeMedicine,2014

(2014),ArticleID

430757,9（SCI收录,影响因子4.774）JuanChen,JunDeng，YuyanZhang,etal.Lipid-loweringeffectsofDanhonginjectiononhyperlipidemiarats.JournalofEthnopharmacology，2014，154(2)：437-442.（SCI收录，影响因子3.014）汪兴宇,张宇燕,万海同,等.参芎注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用.中国中药杂志，2014，39（3）：503-506.（国家一级）周鹏,周惠芬,何昱,等.羟基红花黄色素A在Caco-2细胞单层模型的转运研究.中草药，2014，45（14）：2030-20