王惠敏药包材微生物检验

微生物的基本知识回顾微生物:存在于自然界中的一群体型细小、结构简单、肉眼看不见，必须借助于特殊仪器放大后才能观察到的微小生物。按其结构、化学组成及生活习性可分为:原核类:仅有原始核质，无核仁或核膜，细胞器很不完善，如细菌、放线菌、支原体、立克次氏体、衣原体、螺旋体。

真核类:细胞核的分化程度较高，有核膜、核仁和染色体，细胞器完整，如真菌（酵母菌和霉菌）、原生动物、藻类。非细胞类:体积微小，能通过除菌过滤器，如病毒和朊病毒等。按其致病性可分为:

病原性微生物非病原性微生物当前1页，总共52页。微生物的特点个体小,面积大：小于0.1mm。肉眼不可见。分布广,种类多（10万多种）：自然界中到处都有，如水、空气、土壤等,

土壤中的数量最多。代谢强，转化快：发酵乳糖的细菌在1小时内可分解其自重1000～10000倍的乳糖；产朊假丝酵母合成蛋白质的能力比食用公牛强10万倍。生长旺，繁殖快：微生物有惊人的繁殖速度，大多数微生物几十分钟内就可以繁殖一代。适应性强，易变异（耐药性产生的原因）。当前2页，总共52页。葡萄球菌

酵母菌（芽痕）棒状杆菌大肠杆菌弧状菌链球菌当前3页，总共52页。菌落单位菌落单位---CFU:由单个菌细胞或几个同种菌细胞在培养基上长成肉眼可见的菌落，每个菌落就是1CFU细菌菌落霉菌菌落当前4页，总共52页。包材的微生物污染包材微生物污染：微生物的产生、附着而给包材及生产环境带来不良影响。污染包材的细菌：常见污染包材的细菌是一些生命力较强的细菌，如：葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌及一些霉菌，抵抗力弱的细菌一般不易造成污染。包材的微生物污染源：空气、水、厂房与设备、生产用原辅料、包装材料、生产操作人员等当前5页，总共52页。微生物检验一、实验准备二、培养基的制备三、人流、物流程序四、检验步骤方法五、培养观察与结果判断当前6页，总共52页。洁净室的启用

微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。在检验开始前，应确保：a.洁净室房间、台面等已清洁消毒b.洁净室已臭氧灭菌不少于半小时c.洁净室净化空调系统持续运转不少于1小时，紫外灯已开启d.洁净室中有压差要求的房间压差达到规定实验准备当前7页，总共52页。实验器材、消耗品的准备a.无菌衣、手套、口罩、试管、瓶子、培养皿、消毒剂配制缸、脱脂棉花球b.一次性薄膜过滤滤器、微生物检查薄膜过滤仪c.消毒剂、酒精灯当前8页，总共52页。培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。培养基的制备是检验的重要一环。培养基的制备当前9页，总共52页。培养基制备过程中的注意事项培养基的水化培养基水化使用的容器应是玻璃器皿或搪瓷器皿如三角烧瓶。蒸馏水洗净，烘干后方可使用。不得用铜锅或铁锅,以防有离子混入培养基中,影响微生物的生长；配制培养基最常用的溶剂是纯化水,不能含有任何可能抑制或影响微生物生长的物质；培养基的溶解在培养基分装灭菌前,应溶解均匀,使用电炉等设备煮沸培养基时,应用小火加热,并边加热边搅拌,避免培养基焦化或爆沸溢出。培养基的灭菌已配制好的培养基必须立即灭菌湿热灭菌必须严格控制灭菌温度和时间（121度，15-30分钟，20分钟）当前10页，总共52页。培养基制备过程中的注意事项培养基的保温培养基灭菌后应立即取出，不得储藏在高压灭菌器中，避免造成过度灭菌,影响培养基的营养成分或选择性效果。建议用45℃—55℃水浴锅保温不得超过8小时（60℃的培养箱，温度不同，长时间高温影响培养基质量）。培养基的贮藏配制好的培养基应保存在避光的环境。一般在三周内使用（琼脂培养基不得在0℃或0℃以下存放，防止冷冻破坏凝胶特性）。固体培养基灭菌后的再融化应在加热的水浴中或采用流通蒸汽进行，只允许一次，不得再灭菌。当前11页，总共52页。人流、物流程序物流

将样品、灭菌后的物品、集菌过滤器等转移入传递窗内，打开传递窗内的紫外灯，照射不少于0.5小时。人流检验人员在物品紫外消毒即将结束时，开始进入洁净室。在更衣室脱去外衣和鞋。清洗双手后，在物品柜内取口罩和手套，戴上口罩。打开灭菌后的无菌衣外包装，取出无菌衣，穿戴整齐，要求严格覆盖头发、胡须和颈部。打开手套外包装，取出手套戴上，无菌衣袖口应包裹在手套内。用更衣室内的消毒剂浸泡双手后，自然挥干。进入缓冲走廊，关闭传递窗内的紫外灯后，打开传递窗的门，取出样品和其他实验物品，经二级缓冲，进入操作间。开启超净工作台工作电源，关闭紫外灯，并用75%的酒精喷洒擦拭消毒工作台面。当前12页，总共52页。检验步骤方法检验方法：平皿法、薄膜过滤法

药品检验三种方法，包材检验两种方法的选用仅与最后结果的报告有关,不影响检测的准确性。以铝箔为例，若无菌生长，薄膜法结果为＜1cfu/100cm2，平皿法结果为＜30cfu/100cm2。薄膜法费时费力，但目前标准要求。当前13页，总共52页。药典要求：采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0.45um，直径一般为50mm。经过多次反复实验，发现采用75mm滤膜，菌落计数更方便、清晰。检验过程（以常用的薄膜过滤法为例）当前14页，总共52页。75MM滤器当前15页，总共52页。５０MM、75MM薄膜过滤器

当前16页，总共52页。黑曲霉在75MM膜玫瑰红钠形态

当前17页，总共52页。2023/3/1418金葡菌在75MM薄膜形态75mm薄膜过滤器

当前18页，总共52页。供试液的制备：略过滤：取出三联过滤器，将其固定在集菌仪底座上。在火焰附近打开过滤器的针头，插入供试液瓶中。运行集菌仪调节泵速，一般在150左右。（供试液过滤前先少量的灭菌水过滤以润湿滤膜）细菌、霉菌、酵母菌的检验：过滤后取出滤膜（水要滤干，防止菌成片生长），菌面朝上贴于相应的培养基培养。每种培养基至少制备一张滤膜。

阴性对照试验：提取用水代替供试液同法操作。不得有菌生长。检验步骤当前19页，总共52页。

培养基的浇注：浇注好的平板摇匀后冷却备用（不要把平板垒起来，这样不利于冷却）可以在细菌培养基中加0.1‰的TTC（利于观察计数）当前20页，总共52页。4.控制菌检查

大肠埃希菌（常用，一般内用药包装材料）、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（一般外用药包装材料，如聚丙烯药用滴眼剂瓶）直接将相应培养基加入过滤后的滤筒中培养。阳性对照试验：同相应控制菌的检查，加入10-100cfu的对照菌，应检出相应控制菌。阴性对照试验：提取用水代替供试液同法操作，不得有菌生长。当前21页，总共52页。在操作中不应有大幅度或快速的动作；使用玻璃器皿应轻取轻放；在火焰上方操作；带有菌液的吸管等应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒；使用完毕后，用消毒液擦拭工作台面，关闭工作电源，重新开启紫外灯照射15min。注意事项当前22页，总共52页。培养观察与结果判断培养

培养皿应倒置培养。2010年药典培养时间温度的变化：时间修订为：细菌为3天（原48小时）；霉菌、酵母菌为5天（原72小时），必要时可适当延长培养时间至7天进行菌落计数。控制菌培养温度修改为30℃～35℃（原35℃～37℃）当前23页，总共52页。菌落计数每片滤膜上的菌落数应不超过100个（否则要稀释后过滤）。若滤膜上无菌数生长，以＜1报告菌数。若两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上（例20，40需重新检验）。当前24页，总共52页。控制菌的判断当前25页，总共52页。大肠埃希菌的鉴定靛基质试验MUG试验当前26页，总共52页。大肠埃希菌的鉴定曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心圆形稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。当前27页，总共52页。在营养肉汤培养基中经35℃培养18-24h后，呈均匀浑浊生长。分离培养：甘露醇氯化钠琼脂平板上菌落形态金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环。卵黄氯化钠琼脂平板上菌落形态金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈。生化反应：

血浆凝固酶试验结果：＋

金黄色葡萄球菌的鉴定当前28页，总共52页。金黄色葡萄球菌的鉴定金黄色葡萄球菌在甘露醇氯化钠琼脂上当前29页，总共52页。金黄色葡萄球菌的鉴定血浆凝固酶试验当前30页，总共52页。金黄色葡萄球菌的鉴定血浆凝固酶试验当前31页，总共52页。分离培养：十六烷三甲基溴化铵培养基生化反应：

氧化酶试验（＋）

（培养物呈粉红色渐变为紫红色）绿脓菌素试验（＋）

（盐酸溶液呈粉红色）铜绿假单胞菌的鉴定当前32页，总共52页。铜绿假单胞菌的鉴定铜绿假单胞菌溴化十六烷基三甲铵琼脂当前33页，总共52页。菌种的相关知识菌种是一个国家的重要资源，世界各国对菌种的保藏都极为重视。世界上有700多家菌菌种保藏机构，其中国际知识产权组织承认的法定的保藏机构仅有28家。当前34页，总共52页。1、我国的微生物菌种保藏机构1）普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）中科院微生物所，北京，中科院武汉病毒研究所2）农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）中国农业科学院土壤肥料研究所，北京（ISF）3）工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）中国食品发酵工业科学研究院，北京，（IFFI）4）医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）中国医学科学院皮肤病研究所，南京卫生部药品生物制品检定所，北京中国医学科学院病毒研究所5）抗生素菌种保藏管理中心（CACC）中国医学科学学院抗生素研究所，北京四川抗生素工业研究所，成都华北制药厂抗生素研究所，石家庄6）兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）农业部兽医药品检察所，北京当前35页，总共52页。2、国外主要的微生物菌种保藏机构1）美国标准菌种收藏所（ATCC）2）美国冷泉港研究所（CSH）3）日本东京大学应用微生物研究所（IAM）4）日本东京科研化学有限公司（KCC）5）日本大阪发酵研究所（IFO）6）英国国立标准菌种收藏所（NCTC）7）美国国立卫生研究所（NIH）8）美国农业部北方开发利用研究部（NRRL）当前36页，总共52页。我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管理委员会（CCCCM）管理，涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）提供美国ATCC、NRRL，荷兰的CBS当前37页，总共52页。

中国医学菌种保藏中心提供的标准菌株当前38页，总共52页。

美国国家菌种保藏中心提供的标准菌株当前39页，总共52页。菌种的采购菌种的复苏菌种的传代菌种的使用菌种的保藏菌种的销毁当前40页，总共52页。菌种的采购向指定的菌种保藏机构购置。所购菌种均为冷冻干燥菌种。

购入菌种后，应及时移交实验室。实验室菌种管理人员应仔细核对菌种发放单和冷冻干燥菌种管标签等各项信息，确认无误后，置4～6℃暂存。当前41页，总共52页。菌种的复苏

菌种在打开前应仔细核对标签上菌名、菌号。并注意一株菌种使用一套打开用具，严防交叉污染。

菌种复苏应在生物安全柜内操作。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、可同时接种液体培养基和琼脂培养基斜面。

取琼脂培养基斜面上的菌苔按要求对菌种的纯度进行鉴定。当前42页，总共52页。菌种的复苏干燥菌种(安瓿)的开启

当前43页，总共52页。菌种的传代应在生物安全柜中进行菌种的传代。美国药典（USP）中规定：“将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一次即称为一代，”并规定“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代”。我国的GMP认证中也如此要求，并且中国药典2005年版药典也已做出“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代”这个明确的规定。当前44页，总共52页。常用的传代方法斜面接种划线接种液体接种穿刺接种

当前45页，总共52页。菌种的传代斜面接种时的无菌操作当前46页，总共52页。微生物的环境器皿及培养基的无菌操作者的外界环境及操作过程的无菌（环境及操作的无菌）划线接种当前47页，总共52页。

平板划线法（streakplatemethod）

当前48页，总共52页。菌种的使用菌液的制备：

取铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中，置35～37℃细菌培养箱培养18～24h。

取上述液体培养物1ml，加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，分别10倍稀释至10-5～10-9，制成含菌数小100cfu/ml的溶液，备用。

菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在2～8℃的菌悬液可以在24小时内使用。当前49页，总共52页。菌种的使用铜绿假单胞菌相关：