普通免疫学单克隆抗体

抗体制备与抗原抗体反应及应用

抗体的制备（多克隆与单克隆抗体）基因工程抗体的制备主要的抗原抗体反应免疫学在生物学中的应用当前1页，总共120页。抗体的制备（多克隆与单克隆抗体）抗原上那部分可以引起机体产生抗体的分子结构，叫做抗原决定簇。一个抗原上可以有许多不同的抗原决定簇，因而使机体产生许多不同的抗体。

当前2页，总共120页。抗体的制备（多克隆与单克隆抗体）抗原上那部分可以引起机体产生抗体的分子结构，叫做抗原决定簇。一个抗原上可以有许多不同的抗原决定簇，因而使机体产生许多不同的抗体。

当前3页，总共120页。多克隆抗体具有异质性：如何表示？等电聚焦实验能揭示多克隆抗体中的各种抗体具有不同的等电点。等电聚焦实验：蛋白质在pH梯度胶中电泳，每个分子沿着pH梯度迁移至电荷为中性的相应pH位置，并在此点积聚。多克隆抗体通常用兔制备的当前4页，总共120页。TheimmuneresponsetoanantigengenerallyinvolvestheactivationofmultipleB-cellsallofwhichtargetaspecificepitopeonthatantigen.Asaresultalargenumberofantibodiesareproducedwithdifferentspecificitiesandepitopeaffinitiestheseareknownaspolyclonalantibodies.当前5页，总共120页。用包含多种抗原决定簇的抗原物质免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。因此，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，称为多克隆抗体(polyclonalantibody，pAb)，可以制作“生物导弹”。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，也称为多克隆抗体。当前6页，总共120页。当前7页，总共120页。当前8页，总共120页。抗血清的缺陷：每一种抗血清都不同于其他任何的抗血清，即使选用遗传背景完全相同的动物，采用相同的抗原制剂和相同的免疫程序。产生的抗血清只能是有限的数量，因此同一份血清制剂不可能长期使用或完成一系列复杂的实验或临床检测。即使是用亲和层析技术纯化的抗体也可能包含少量引起交叉反应的抗体，干扰对实验的分析。当前9页，总共120页。发展一种无限量能产生结构均一且已知特异性的抗体分子方法。当前10页，总共120页。1975年Kǒhler和Milstein首先报道用细胞杂交技术使经绵羊红细胞（SRBC)免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,建立起第一个B细胞杂交瘤细胞株,并成功地制得抗SRBC的单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb）。迄今世界已研制成数以千计的McAb。当前11页，总共120页。"fortheoriesconcerningthespecificityindevelopmentandcontroloftheimmunesystemandthediscoveryoftheprincipleforproductionofmonoclonalantibodies"Jerne

KǒhlerMilsteinTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1984当前12页，总共120页。由一种克隆产生的针对一种细胞表位的特异性抗体叫做单克隆抗体。MonoclonalantibodiesrepresentasingleBlymphocytegeneratingantibodiestoonespecificepitope.单克隆抗体为单一种B细胞克隆所产生的一种均一的免疫球蛋白，是一种独特型的抗体。它的特异性是针对一个抗原决定簇的。当前13页，总共120页。单克隆抗体的原理

骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，因此能在体外长期培养，但不能分泌特异性抗体；B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖，因此不能长期培养。免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。当前14页，总共120页。在制备杂交瘤过程中的一个问题是什么？如何解决？让未成杂交瘤的骨髓瘤细胞和脾脏细胞去死当前15页，总共120页。

HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养。

当前16页，总共120页。5-磷酸核糖焦磷酸尿嘧啶RNADNA

次黄嘌呤（H）

胸腺嘧啶（T）氨基蝶呤（A）合成主要途径

合成替代途径

TKHPGRTHPGRT：次黄嘌呤鸟嘌呤核苷转移酶TK：胸腺嘧啶激酶当前17页，总共120页。未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成核酸的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤合成核酸而死亡。

当前18页，总共120页。融合的杂交瘤细胞由于从脾脏细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。当前19页，总共120页。未融合的亲代脾脏细胞寿命有限，不久就死亡了。当前20页，总共120页。当前21页，总共120页。

三、单克隆抗体的制备过程

杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤包括：

（1）抗原制备；

（2）免疫动物；

（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；

（4）细胞融合；

（5）杂交瘤细胞的选择培养；

（6）杂交瘤细胞的筛选；

（7）杂交瘤细胞的克隆化；

（8）单克隆抗体的检定；

（9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；

（10）单克隆抗体的大量制备。当前22页，总共120页。1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

2、细胞融合采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。当前23页，总共120页。

3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成核酸而死亡。未融合的脾细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤－鸟嘌呤－磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。当前24页，总共120页。4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌所需特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。当前25页，总共120页。

5、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。

（1）体内诱生法取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。当前26页，总共120页。（2）体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。当前27页，总共120页。鼠单抗也具有一些缺陷，主要是小鼠免疫系统不能识别某些免疫原。另一方面，由于多克隆抗体识别的是抗原的多个抗原决定簇，同时抗体的亲和性要远远高于鼠来源的抗体，再加上技术环节的简单性，所以一直具有不可取代的优势，也广泛应用于科研及诊断。如何得到高亲和性、强特异性、广谱识别性的抗体？

当前28页，总共120页。

实验动物的选择：做单抗的动物最开始是小鼠，后来又有像epitomics这样的公司用兔子的(有特殊的专利)，还有一些人用大鼠神马的，当然其它的动物的也有，据不完全统计，现在能用传统方法制备单抗的动物已经有二三十种了。但是最主流的还是小鼠和兔子了。当前29页，总共120页。Monoclonalantibodies(mAbs)fromrabbitshavenotbeenavailablebecausenorabbitplasmacytomas(骨髓瘤样肿瘤),fromwhichahybridomafusionpartnercouldbegenerated,havebeenidentified.当前30页，总共120页。1995年，Dr.KatherineKnight在LoyolaUniversityofChicago成功地在在转基因兔中获得骨髓瘤样肿瘤(plasmacytoma)。其后几年里，Dr.RobertPytela和Mr.WeiminZhu在UCSF将此技术进行了改进，使之能高产量的生产兔单克隆抗体。兔单克隆抗体(RabMAbs)：新一代单克隆抗体用于科研、诊断和治疗当前31页，总共120页。如何获得骨髓瘤样肿瘤?当前32页，总共120页。在c-myc/v-abl转基因兔身上成功地获得了兔浆细胞瘤细胞系当前33页，总共120页。proto-oncogenes(原癌基因)

调控细胞生长和增殖的正常细胞基因。突变后转化成为致癌的癌基因myc转录因子Burkitt淋巴瘤、肺癌、早幼粒白血病Abl-1:非受体酪氨酸激酶慢性髓性白血病当前34页，总共120页。当前35页，总共120页。当前36页，总共120页。当前37页，总共120页。美国Epitomics公司成立于2001年9月，与加州大学旧金山分校(UCSF)及芝加哥LOYOLA大学联手开发出新型杂交瘤技术，拥有兔单克隆抗体(RabMabs)技术的全球专利，是国际上唯一一家拥有兔类单抗技术的生物技术公司。

当前38页，总共120页。2012年3月6日英国上市公司Abcam宣布将以1.7亿美元收购全球唯一兔单株抗体蛋白生物技术公司Epitomics(F-宜佰)Epitomics当前39页，总共120页。当前40页，总共120页。当前41页，总共120页。由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高通量筛选融合细胞成为可能。预期后10年数百种治疗性抗体将被开发用于许多疾病的治疗。鼠单克隆抗体与兔单克隆抗体的比较亲和力更高:可以比鼠抗血清识别更多种类的表位

识别表位更多:能够识别许多小鼠中不产生免疫的抗原

特异性更高、检测灵敏度更高、应用范围更广、背景本底更低当前42页，总共120页。当前43页，总共120页。当前44页，总共120页。浆细胞肿瘤当前45页，总共120页。基因工程抗体的制备生物导弹的原理:生物导弹是免疫导向药物的形象称呼，它由单克隆抗体与药物、酶或放射性同位素配合而成，因带有单克隆抗体而能自动导向，在生物体内与特定目标细胞或组织结合，并由其携带的药物产生治疗作用。

当前46页，总共120页。单克隆抗体具有高度专一性，能够识别细胞表面抗原、各种受体、各种体液成分及细胞内和组织内的各种成分，能精确地瞄准和捕获靶细胞，特异性地与靶目标发生反应，因而有“生物导弹”之称。

单抗体引导药物或毒素到达抗原存在部位使药物或使毒素发挥更有效的作用.从而减少药物、毒素、同位素和酶在肿瘤治疗过程中引起严重的副作用,大大提高治疗肿瘤的效果。当前47页，总共120页。用鼠单克隆抗体制备的生物导弹有什么问题？当前48页，总共120页。杂交瘤是鼠来源的，因此产生的抗体也是鼠源的蛋白，对于人体而言是一种异种蛋白。异种蛋白在人体内可能会引起免疫反应（哮喘、荨麻疹/风疹块，产生抗体等）或被排斥，有时会引起严重的致死性反应，因此自1980年代以来，如何解决生物导弹的这个问题，一直是生物导弹在人体内应用的重要问题。当前49页，总共120页。FR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4V区当前50页，总共120页。抗体基因的改造将鼠源抗体的V区与人源抗体C区基因重组，获得的嵌合体（chimericalantibody),可保留鼠抗体对抗原的高亲和性，又减弱鼠抗原对人的免疫原性，提高治疗性抗体的效果。解决方法当前51页，总共120页。鼠单抗恒定区人源化鼠单抗恒定区人源化当前52页，总共120页。当前53页，总共120页。如何得到亲和力高、特异性强的抗体克隆？通过遗传工程技术改造与生产抗体当前54页，总共120页。抗体基因文库将不同的重链和轻链基因随机组合，克隆到合适的表达载体（噬菌体）中，在原核细胞表达不同的抗体，形成一个抗体库。从这个抗体库中，用抗原可以筛选到相应的抗体基因。优点：一是从不适合进行人工免疫的物种获得单克隆抗体，如人源单克隆抗体；二是可快速方便获得亲和力高、特异性强的克隆抗体。当前55页，总共120页。主要的抗原抗体反应当前56页，总共120页。当前57页，总共120页。抗体效价的测定血清：血液凝固析出的淡黄色透明液体，在凝血过程中，纤维蛋白原转变成纤维蛋白块，所以血清中无纤维蛋白原。抗体效价(滴度，titer)：通过血清学方法能显示一定反应的抗血清(或抗体)的最高稀释倍数(或稀释度的倒数)。如终点稀释度为1/100，则血清的效价(每1ml的血清中抗体效价)为100抗体单位的高低是衡量血清中抗体水平的一项检测指标。

当前58页，总共120页。试管凝集实验（tubeagglutinationtest）原理：大分子颗粒性抗原（细菌、红细胞）与其相应的抗体相结合，在适量的电解质存在及一定的温度下，经过一定的时间可出现肉眼可见的凝聚团块。一般以标准抗原测得免疫血清或患者血清中抗体的效价。当前59页，总共120页。不加免疫血清＋＋＋＋、＋＋＋、＋＋、＋：凝聚强度＋：出现凝聚－：无凝聚当前60页，总共120页。抗体与多价抗原结合的浓度带现象当前61页，总共120页。抗体稀释度应根据：①抗体效价高，溶液中特异性抗体浓度越高，工作稀释度越高；②一般讲，应用的抗体稀释度越大，温育时间越长。③抗体中非特异性蛋白含量、只有高稀释度时才能防止非特异性背景染色；抗体的稀释主要是指第一抗体，因为第一抗体中特异性抗体合适的尝试是关键,应用高稀释度第一抗体仅显示主亲和力的特异性染色反应,减少或消除其中交叉抗体反应。当前62页，总共120页。三、常见免疫分析方法利用抗原与抗体特异性反应的特性对抗原或抗体进行量和质的测定分析。这类分析方法具有特异、灵敏和快速的特点。免疫沉淀1.环状沉淀实验：是溶液中的沉淀反应。在体外当抗体与相应抗原二者浓度比例恰当时，会发生免疫沉淀。当前63页，总共120页。免疫监测免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)分离蛋白当前64页，总共120页。人绒毛膜促性腺激素（HCG）的免疫监测尿液胶乳胎盘合体滋养层细胞产生大量的人绒毛膜促性腺激素，可通过孕妇血液循环而排泄到尿中当前65页，总共120页。人绒毛膜促性腺激素的免疫监测-阴性对照当前66页，总共120页。Co-IP工作示意图Co-immunoprecipitationbinding

wash

elutionYYYYY当前67页，总共120页。免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)分离蛋白当前68页，总共120页。当前69页，总共120页。Identifyingspecificproteininteractionpartnersusingquantitativemassspectrometryandbeadproteomes当前70页，总共120页。2.免疫双扩散抗原抗体在半透明的半固相介质中进行沉淀实验。双扩散是在琼脂板中抗原和抗体分别从相邻的孔中向四周扩散，在抗原孔和抗体孔之间二者比例合适的部位形成沉淀线。当两个抗原完全一致时，两条沉淀线完全融合；如果两个抗原无共同抗原决定簇时，沉淀线互不干扰；当两个抗原只是部分抗原决定簇相同，还有其他不同的抗原决定簇，则沉淀线在后者一方形成突出的小刺当前71页，总共120页。3.免疫电泳利用蛋白质在凝胶中电泳迁移率不同能被分离开来的特点与免疫扩散结合一起进行分析的方法。当前72页，总共120页。1、血清免疫电泳:双扩散当前73页，总共120页。当前74页，总共120页。2、火箭电泳：为加速度的单向免疫扩散(抗原扩散,抗体不扩散)与电泳结合的一种方法在含抗体的琼脂板一端打一排抗原孔；加入待测标本后，将抗原置阴极端，抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，形成峰状的沉淀区，状似火箭。抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量呈正比，用标本中的抗原含量。当前75页，总共120页。常用于标记抗原的放射性同位素有3H、125I、131I、14C等。3H可以置换有机化合物中的氢，不影响原有化学性质，且半衰期长和能量低，便于防护。125I的敏感度约比14C大3900倍。又因为125I有合适的半衰期，低能量的γ射线易于标记，标记物。

标记方法简便，多肽、蛋白质与小分子半抗原均可进行碘标记。一些不能直接用碘标记的半抗原，通过接上一个酪氨酸亦可用碘标记之。当前76页，总共120页。氯胺T直接标记法。氯胺T是一种氧化剂。在偏碱溶液中（pH7.5），氯胺T将125I的I－氧化为I+，I+取代蛋白质酪氨酸苯环的氢，形成二碘酪氨酸。当前77页，总共120页。发光免疫分析用发光物质标记抗体。根据发光物的来源不同,有化学发光(chemiluminessence)和生物发光(bioluminescence)：化学发光供能反应为一般化学反应。指某种物质分子吸收化学能而产生的光辐射。例如化学发光剂如荧光醇（luminol）发生高能化学反应，形成处于电子激发态的分子，当回到基态时，伴随光子的释放，发生化学反应。当前78页，总共120页。用于标记的酶的种类:碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)b-半乳糖苷酶(b-galactosidase)当前79页，总共120页。广泛使用,因酶促反应使测定的结果被放大,反应灵敏度高b.间接法:用酶标第二抗体来检查第一抗体是否与抗原结合,避免了用酶标记每一种抗原或抗体的复杂过程。a.直接法:用酶标第一抗体来检查第一抗体是否与抗原结合。酶联免疫分析法当前80页，总共120页。生物发光是指生物体发光或生物体提取物在实验室中发光的现象。它不依赖于有机体对光的吸收，而是一种特殊类型的化学发光，化学能转变为光能的效率几乎为100%。也是氧化发光的一种。生物发光的一般机制是：由细胞合成的化学物质，在酶的作用下，使化学能转化为光能：虫荧素（luciferin）在虫荧酶（lucifase）的催化下，有ATP，Mg2＋及O2存在时，发生瞬时发光反应。

当前81页，总共120页。PrincipleofWesternblottingwithEnhancedChemiluminescence(ECL)detectionsystem免疫学在生物学中的应用当前82页，总共120页。当前83页，总共120页。当前84页，总共120页。当前85页，总共120页。当前86页，总共120页。当前87页，总共120页。当前88页，总共120页。当前89页，总共120页。当前90页，总共120页。当前91页，总共120页。当前92页，总共120页。Indirectdetectionmethod当前93页，总共120页。化学发光(chemiluminescent)原理发光液A和B分别是Luminol和过氧化氢，在辣根过氧化物酶（HRP）的催化作用下,Luminol与过氧化氢反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体,当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。在发光过程中不需要消耗HRP,HRP只是起催化作用，所以只要HRP没降解失活,是可以重复加发光液的。但HRP作为一种蛋白酶,在室温放置时间过长,是会降解的；同时在发光过程中有什么物质(比如显影液)污染了膜的话,也有可能灭活膜上的HRP。当前94页，总共120页。LumigenPS3:化学发光检测中与辣根过氧化物酶结合的底物

,producesamoreintenselightemissionoflingerduration当前95页，总共120页。当前96页，总共120页。当前97页，总共120页。当前98页，总共120页。样品1样品2当前99页，总共120页。当前100页，总共120页。当前101页，总共120页。电泳迁移率：在特定介质中单位电场强度的带电颗粒电泳移动速度。电泳迁移率与颗粒所带电荷量成正比，与颗粒的半径和介质黏度成反比。实际工作中常用相对电泳迁移率，即两种带电颗粒在同一介质、同一电场中泳动距离之比。一般情况下电泳中蛋白质分子量对数与迁移率呈线性关系。当前102页，总共120页。问题单克隆抗体是如何制备的？什么是免疫共沉淀？Western杂交试验？当前103页，总共120页。(荧光醇)(过氧酸,-O-O-)当前104页，总共120页。放射免疫分析：当前105页，总共120页。免疫荧光分析:将荧光化合物标记抗体。需要激发，才能发出荧光。当前106页，总共120页。当前107页，总共120页。当前108页，总共120页。IRDyenearinfraredfluorescentdyesa