基因工程的主要技术原理

GeneticEngineering第三章基因工程的主要技术原理当前1页，总共187页。第三章

基因工程的主要技术原理当前2页，总共187页。由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。第一节DNA的提取与纯化当前3页，总共187页。当前4页，总共187页。大肠杆菌基因组DNA当前5页，总共187页。一、质粒DNA的提取当前6页，总共187页。plasmidDNAThegenomicDNAofE.coli:asinglecirculardouble-strandedDNA,withthecontourlengthabout850timeslongerthanthecell.

GenomicDNA当前7页，总共187页。闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；（1）原理1.碱抽提法提取质粒DNADNA双链变性DNA单链复性强碱中性闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；（1）原理1.碱抽提法提取质粒DNADNA双链变性DNA单链复性强碱中性当前8页，总共187页。染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。变性当前9页，总共187页。（2）

所用的试剂作用①

溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。在碱性条件（pH>8）下有活性。②

葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。（2）

所用的试剂作用①

溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。在碱性条件（pH>8）下有活性。②

葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。当前10页，总共187页。③EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS:

溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。当前11页，总共187页。冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。⑥

乙醇DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。⑤NaAc-HAc缓冲液当前12页，总共187页。⑦RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE缓冲液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。

Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。当前13页，总共187页。蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。⑨

酚-氯仿选用以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。当前14页，总共187页。（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤

SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。第一步：溶菌50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA当前15页，总共187页。溶液II

破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。第二步：破膜，蛋白质和DNA变性SolutionII的配制：第三步：中和溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。SolutionIII的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS3M醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）当前16页，总共187页。上清液中含有闭合质粒DNA。第四步：离心除去沉淀0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。第五步：纯化DNA上清液过柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA当前17页，总共187页。最重要的是：2.影响质粒DNA产量的因素菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数。一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。（1）受体菌株endA基因编码核酸内切酶Ⅰ，在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断。当前18页，总共187页。这是直接决定DNA产量的重要因素之一。（3）质粒大小分子量大的质粒，拷贝数少。（2）质粒拷贝数质粒本身的性质所决定。当前19页，总共187页。若干常用质粒的理论产量质粒名分子大小bp拷贝数质粒产量g/ml

pGEMpUCpBR322ColE1pACYCpSC101270027004400450040009000300-700500-700>25>15≈10≈61.8-4.12.9-4.1>0.32>0.15≈0.09≈0.12若干常用质粒的理论产量质粒名分子大小bp拷贝数质粒产量g/ml

pGEMpUCpBR322ColE1pACYCpSC101270027004400450040009000300-700500-700>25>15≈10≈61.8-4.12.9-4.1>0.32>0.15≈0.09≈0.12当前20页，总共187页。二、基因组或其他DNA的提取

一般过程及原理：

1.细菌基因组DNA的制备（1）细胞裂解10%SDS和蛋白酶K。37oC温育。不用NaOH!当前21页，总共187页。（3）沉淀DNA0.6倍体积的异丙醇。（2）DNA纯化CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)除去多糖，酚-氯仿-异戊醇除去蛋白。当前22页，总共187页。

一般过程及原理：动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末。

组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。（1）组织粉碎2.哺乳动物细胞基因组DNA的抽提当前23页，总共187页。0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50oC温育。（2）细胞裂解（3）纯化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。SDS是离子型去垢剂（detergent），可以使细胞膜崩解。（5）除去RNA污染用RNase。用2倍体积的无水乙醇。（4）沉淀DNA（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）当前24页，总共187页。

一般过程及原理：

（1）组织粉碎用液氮冷冻后研磨成细粉末。3.从植物组织中制备DNA（2）细胞裂解用2%CTAB/2-ME(十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇）。或1%SDS和蛋白酶K。65oC温育。当前25页，总共187页。用0.6倍体积的异丙醇（-20oC）。（3）纯化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。（4）沉淀DNA（5）除去RNA污染用RNaseA。（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）。当前26页，总共187页。三、DNA的定量和纯度测定1.紫外光谱法DNA（或RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。用微量比色杯（10l）在紫外分光光度计直接测定。原理：蛋白质在280nm处有吸收峰当前27页，总共187页。22当前28页，总共187页。溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发

红色荧光。2.琼脂糖凝胶电泳估计原理：与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。当前29页，总共187页。一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。DNA分子量Marker有许多公司的商品，使用非常方便。如DNA的HindⅢ酶切物等。四、DNA分子量的估计MarkerMarker当前30页，总共187页。DNAladder28kb2500bp2300bp1300bp900bp750bp200bp5000bp20kb1000bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp100bpDNAMarkerDNAladder28kb2500bp2300bp1300bp900bp750bp200bp5000bp20kb1000bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp100bpDNAMarker当前31页，总共187页。C

TranscriptlevelsofriceKNOXgenesOSH1andOSH3revealedbyRT-PCRinleavesfromwild-type(WT),phenotypicYAB3RNAi(Y1andY2),andWOX3overexpressionplants(W1andW2).ShootapexmRNAwasusedasapositivecontrol(S).当前32页，总共187页。1.带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。2.电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。3.电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。

一、电泳的基本原理第二节DNA的凝胶电泳当前33页，总共187页。4.如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）：分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关:分子量越大，移动越慢。摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。5.当前34页，总共187页。Relaxed

supercoiled

Increasingdegreeofsupercoiling

相同分子量的DNA:闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开环状最慢。当前35页，总共187页。当前36页，总共187页。当前37页，总共187页。Agarosegelelectrophoresis

Gelelectrophoresisisnotonlyusedasananalyticalmethod,itisroutinelyusedpreparativelyforthepurificationofspecificDNAfragments.Thegeliscomposedof:

Agarose:forDNAfragmentsranginginsizefromafewhundredbasepairstoabout20kb(Fig.2.1).

Polyacrylamide:forsmallerDNAfragments.当前38页，总共187页。Fig.2.1ElectrophoresisofDNAinagarosegels.DNAbandshavebeenvisualizedbysoakingthegelinasolutionofethidiumbromide(seeFig.2.2),whichcomplexeswithDNAbyintercalatingbetweenstackedbase-pairs,andphotographingtheorangefluorescence.当前39页，总共187页。Fig.2.2Ethidiumbromide.

当前40页，总共187页。Agarosegelisacomplexnetworkofpolymericmoleculeswhoseaverageporesizedependsonthebuffercompositionandthetypeandconcentrationofagaroseused.当前41页，总共187页。Inanyevent,gelelectrophoresisisfrequently

performedwithmarkerDNAfragmentsofknown

size,whichallowaccuratesizedeterminationofan

unknownDNAmoleculebyinterpolation(插入).

InadditiontoresolvingDNAfragmentsofdifferentlengths,gelelectrophoresiscanbeusedtoseparatedifferentmolecularconfigurationsofaDNAmolecule.当前42页，总共187页。Gelelectrophoresiscanalsobeusedforinvestigatingprotein–nucleicacidinteractions,basedontheobservationthatbindingofaproteintoDNAfragmentsusuallyleadstoamobilityreduction.当前43页，总共187页。二

、琼脂糖凝胶电泳1.琼脂糖2.琼脂糖凝胶琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。

浓度高空隙小当前44页，总共187页。琼脂糖的浓度（%）分离DNA的片断大小（bp）0.30.71.450000—100020000—10006000—300空隙小，分辨率高：小分子较易通过，而大分子难通过；空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过。3.琼脂糖凝胶的分辨力空隙大小决定其分辨分子大小的能力。当前45页，总共187页。

1、概述：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。三

、聚丙烯酰胺凝胶电泳当前46页，总共187页。优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。聚丙烯酰胺凝胶浓度（%）分离DNA片断大小（bp）4.010.020.01000—100500—2550—1三

、聚丙烯酰胺凝胶电泳其优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。聚丙烯酰胺凝胶浓度（%）分离DNA片断大小（bp）4.010.020.01000—100500—2550—1琼脂糖凝胶电泳：1000——50000bp聚丙烯酰胺凝胶电泳：1——1000bp当前47页，总共187页。2、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理与装置（Polyacrylamidegelelectrophoresis）在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。电泳buffer电泳buffer当前48页，总共187页。电泳方向当前49页，总共187页。当前50页，总共187页。已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。商品化供应Da道尔顿(质量单位,等于一氧原子质量的十六分之一。一克约为6×1023道尔顿3、蛋白质电泳的分子量标准当前51页，总共187页。DaltonSDSPAGE当前52页，总共187页。4、凝胶中的蛋白质染色：考马斯亮蓝：灵敏度底、只能检出>0.3-1μg/带，但可褪色回收。

硝酸银：灵敏度高、可检出2-5ng/带。2）转到膜上进行染色。1）直接染色当前53页，总共187页。直接染色电泳结果当前54页，总共187页。四、凝胶染色1.染料溴化乙锭。Ethidiumbromide（EB）当前55页，总共187页。EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。荧光强度与DNA含量及大小成正比。2.原理当前56页，总共187页。

当前57页，总共187页。当前58页，总共187页。UVP全自动凝胶成像分析系统当前59页，总共187页。OMEGA8-LOGO全自动凝胶成像分析系统当前60页，总共187页。

核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹交（Southernblothybridization）和RNA印迹杂交（Northernblothybridization）。第三节

核酸的分子杂交

当前61页，总共187页。DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针。当前62页，总共187页。

Southern杂交的基本原理是将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

一、Southernblot当前63页，总共187页。Southernblot用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。当前64页，总共187页。当前65页，总共187页。当前66页，总共187页。Southernblot筛选结果当前67页，总共187页。二、Northernblot用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。

在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同SouthernBlot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。其用途是检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。主要检测插入片断是否被转录。当前68页，总共187页。

蛋白质印迹(westernblot)，又称免疫印迹(immunoblotting)是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。

WesternBlot基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。WesternBlot采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。三、WesternBlot＃当前69页，总共187页。Westernblotting电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。①Western（转膜）胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。膜胶蛋白当前70页，总共187页。②Blotting原理与ELISA相同。待测蛋白硝酸纤维素膜一抗二抗辣根过氧化物酶底物产物，并发出光PAGE胶待测蛋白底片曝光辣根过氧化物酶：HRPO当前71页，总共187页。当前72页，总共187页。1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与

膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。4）清洗掉未结合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。③Blotting过程ImmunoBlotting当前73页，总共187页。④结果多克隆抗体Blotting的结果单抗blotting结果当前74页，总共187页。四、

原位杂交对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。需要目的基因的探针。当前75页，总共187页。3当前76页，总共187页。第四节

基因

扩增技术PCR一、基因扩增（geneamplification)指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。有下列五种方式：1.环境诱发扩增2.基因的程序性扩增5.PCR扩增3.基因组进化扩增4.基因工程扩增当前77页，总共187页。1.环境诱发扩增如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。2.基因的程序性扩增如非洲爪蟾卵子形成过程中rRNA基因的扩增。当前78页，总共187页。生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚集成簇。5.PCR扩增应用聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因。3.基因组进化扩增4.基因工程扩增载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。当前79页，总共187页。（1）1.PCR的发明二、PCR技术（2）Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。1985年Cetus公司的科学家K.B.Mullis发明了PCR，使这一设想变成现实。1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想。当时由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现。PolymeraseChainReaction当前80页，总共187页。当前81页，总共187页。（3）TaqDNA聚合酶1988年R.K.Saiki把TaqDNA聚合酶用到PCR反应中。使

PCR自动循环仪成为可能。（4）PCR仪1988年Cetus公司发明自动热循环仪。1986年H.A.Erilish从嗜热

水生菌分离出耐高温的TaqDNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37oC)，PCR技术才进入实用阶段。当前82页，总共187页。当前83页，总共187页。PCR仪当前84页，总共187页。2.PCR技术的原理模板DNA变性引物DNA复性引物DNA延伸当前85页，总共187页。双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。TGCATGCATATCTTGAACTAGAACTTGACGTACGTATGCATGCATATCTTGAAC3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

TAGAACTTGACGTACGTA95oC（1）DNA模板变性模板模板（template）95oC当前86页，总共187页。TGCATGCATATCTTGAAC3’

5’

5’

TAGAACTTGACGTACGTA3’

人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。（2）DNA模板与引物复性模板模板ATCTTGAAC5’

3’

ACGTACGTA5’

3’

引物引物引物（primer）:40-65oC当前87页，总共187页。DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。（3）DNA链的延伸TGCATGCATATCTTGAAC3’

5’

5’

TAGAACTTGACGTACGTA3’

模板模板ATCTTGAAC5’

ACGTACGTA5’

TaqTaq72oC当前88页，总共187页。理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。变性—复性—延伸。（5）1个循环的结果（4）新一轮循环开始DNAelongation当前89页，总共187页。3.PCR的过程（1）第一步

变性（denature）94-95oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。（2）第二步

复性（anneal）50-60oC下1分钟，引物优先与模板复性。①引物的浓度高，②引物的链短。当前90页，总共187页。94oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。（4）第四步

变性（denature）72oC下1-2分钟，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。（3）第三步

延伸（extend）（5）第五步

重复（repeat）当前91页，总共187页。第二步——第三步——第四步复性延伸变性95oC5min50oC1min72oC2min94oC1min温度循环当前92页，总共187页。PCR仪的温度循环程序当前93页，总共187页。当前94页，总共187页。PCR当前95页，总共187页。需要的模板量极低。4.PCR的特点（1）特异性强

①PCR使用专门合成的DNA引物。②延伸过程是在高温下进行。（2）敏感性高

这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！当前96页，总共187页。RT-PCR：对模板的纯度要求低。（5）可以扩增mRNA（4）简便

先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。（3）快速

整个PCR过程约4小时即可完成。不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。当前97页，总共187页。自从H.A.Erilish分离出耐高温的TaqDNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37oC)，PCR技术才进入实用阶段。（1）TaqDNA聚合酶

5.影响PCR的因素TaqDNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。①

热稳定性当前98页，总共187页。最适温度：

75-80oC

延伸速度：

约35-150nt/s.酶分子最长延伸长度：6.7kb②

最适温度高③Taq酶的功能缺点具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性，但没有3‘5’外切酶活性。因此不能修复错误的碱基配对！

合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。当前99页，总共187页。金属离子敏感（尤其是Mg2+

）。当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。④TaqDNA聚合酶的激活剂50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合酶的活性。4金属离子敏感（尤其是Mg2+

）。当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。④TaqDNA聚合酶的激活剂50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合酶的活性。4当前100页，总共187页。（2）其它耐热的DNA聚合酶

①TthDNA聚合酶无3’5’DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA。②VENTDNA聚合酶有3‘5’外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受100oC高温。当前101页，总共187页。③PfuDNAPolymerase④

TaqPlusDNAPolymerase有3’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性。但PCR产物为平端！

是目前已发现的所有耐高温DNA聚合酶中出错率最低的。是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物。

Taq的PCR产物3’端往往带有一个A。当前102页，总共187页。与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（

5‘端相同）的短DNA。（3）引物（primer)①位置3’

3’

当前103页，总共187页。即2.751011bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约2×10-11）。②引物的长度理论计算：419=2.751011。一般引物设计为长15—30bp。当前104页，总共187页。③引物的碱基序列

5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’

3’GCTAGCTACTTAAG5’

3’端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。templateprimer当前105页，总共187页。尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力;④引物的碱基组成避免连续相同碱基排列或内部回文序列。5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’

CTGCCAGTCTAC3’

GACGG5’

T发卡结构1）2）当前106页，总共187页。3）避免形成引物二聚体（dimer）。两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。5’GGTCTGCCAGTCTAC3’

3’CAGGACTTAGTCACT5’

primer1primer2UpstreamprimervsDownstreamprimerSenseprimervsAntisenseprimerPrimer1vsPrimer2ForwardprimervsReverseprimer当前107页，总共187页。⑤引物的Tm值Tm=（G+C)4+(A+T)2当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55oC。适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。实际复性温度选择低于Tm值5oC。手工计算：一般估计：当前108页，总共187页。⑥引物的浓度一般使用终浓度各0.5mol/L。⑦简并引物如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。当前109页，总共187页。设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。引物设计现在多用专业软件

⑧套嵌引物（nestedprimers)1324如Primer5.0等当前110页，总共187页。Primer5.0当前111页，总共187页。当前112页，总共187页。当前113页，总共187页。当前114页，总共187页。当前115页，总共187页。当前116页，总共187页。当前117页，总共187页。当前118页，总共187页。当前119页，总共187页。当前120页，总共187页。当前121页，总共187页。当前122页，总共187页。当前123页，总共187页。但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。（4）模板（template)②

模板的量：不能太多，100l反应体系中100ng足够。①

纯度：PCR对模板DNA的纯度要求不高。当前124页，总共187页。dNTPs是dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。（5）dNTPs一般反应体系中dNTPs混合液终浓度用0.2mmol/L。浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加错配率。当前125页，总共187页。TaqDNA聚合酶要求有游离的Mg2+

。（6）Mg2+

的浓度

所以Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）。一般用的MgCl2终浓度。当前126页，总共187页。借助于荧光信号来检测PCR产物。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。

6.PCR技术的扩展（1）荧光实时定量PCRReal—time

PCR（或TaqMan

PCR）Ct值：样品到达域值水平所经历的循环数。

当前127页，总共187页。扩增两个引物外侧的未知序列（2）反向PCR把线性DNA模板转变成环形分子。templatetemplate3’

5’

5’

3’

（传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。技术关键：当前128页，总共187页。使引物的外侧序列“转变”成内侧序列。当前129页，总共187页。低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后产物中99%是单链DNA。（3）不对称PCR3’

5’

5’

3’

引物少用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。技术关键：两个引物的浓度相差100倍。当前130页，总共187页。扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。（4）反转录PCR（RT-PCR)Temin,H.发现反转录酶，1975诺贝尔奖技术关键：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。当前131页，总共187页。RNAtemplate3’

5’

下游引物cDNAfirststrand3’

5’

上游引物cDNAfirststrandcDNAsecondstrand3’

5’

3’

5’

反转录酶Taq酶PCRReversetranscription(RT)下游引物上游引物Taq酶当前132页，总共187页。Fig.3.RT-PCRanalysisofGbd1andGbd2inPima90followinginfectionbyV.dahliaeafter0,2,4,8,12,24,48,72and96h,respectively.M:100bpDNAladder.his-3ofcottonasthecontrol.当前133页，总共187页。7.PCR技术的应用（1）扩增某一段DNA从基因组中扩增；从载体上扩增；组织样本原位扩增；微量残留DNA扩增；分析模板序列；当前134页，总共187页。在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。（2）基因的体外诱变技术关键：利用引物的5‘端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。（2）基因的体外诱变技术关键：利用引物的5‘端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。（2）基因的体外诱变技术关键：利用引物的5‘端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。当前135页，总共187页。设计引物定点诱变当前136页，总共187页。利用6bp长度的随机序列引物扩增细胞中的总DNA，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。（3）基因组的比较研究

比较不同物种之间的基因组特征和相似性。类似于限制性内切酶片断长度多态性（RFLP）分析，因而也称为随机扩增多态性DNA（RAPD）分析。RAPD(RandomamplifiedpolymorphismDNA)当前137页，总共187页。1970年人们就有足够的理论知识来提出目前所用的快速DNA序列分析法。但当时在认识上和技术上存在两个问题：当时没有能把不同长度的核苷酸片断分离开的技术。当时的分析思路局限于RNA序列分析法。第五节DNA序列分析（1965年Cornell大学的S.W.Holley等首次测定了75bp的酵母丙氨酸tRNA全序列。使用的是降解片断法）。5当前138页，总共187页。Sanger等1977年发明。一、双脱氧链终止法FrederickSanger,1980年NobelPrize化学奖当前139页，总共187页。（1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配

对的原则进行的。（2）脱氧核糖的连接是以3’5’磷酸二脂键。（3）复制反应可以在体外进行。（4）2’和3’双脱氧的ddNTP会使复制反应终

止。1.原理

当前140页，总共187页。当前141页，总共187页。当前142页，总共187页。（1）制备单链DNA模板2.技术要点

就是待测序的DNA链。①不能有5’3’和3’5’的外切酶活性；②与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。

（3）特殊的DNA多聚酶dNTP/ddNTP=100/1

（4）制备2’和3’双脱氧的ddNTP时,DNA电泳带谱的分离效果最好，可读出200多个核苷酸序列。当前143页，总共187页。需带有放射性或荧光标记。（2）制备一小段单链引物（DNA或RNA）当前144页，总共187页。3.Sanger双脱氧终止法测序过程当前145页，总共187页。当前146页，总共187页。模板序列当前147页，总共187页。1977年，哈佛大学的A.M.Maxam和W.Gilbert发明。二、Maxam-Gilbert化学修饰法WalterGilbert,1980年NobelPrize化学奖当前148页，总共187页。末端放射性标记的DNA片单链长度只差一个核苷酸的DNA链混合物化学试剂处理凝胶电泳放射性自显影阅读碱基顺序特定的碱基中引入化学基团DNA在被修饰的核苷酸位置断裂1.原理

当前149页，总共187页。碱基特异修饰方法GpH8.0,用硫酸二甲脂对N7进行甲基化，使C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0,哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化，从而导致脱嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键C+T肼可打开嘧啶环，后者重新环化成五元环后易于除去C在1.5mol/LNaCl存在时，可用肼除去胞嘧啶2.碱基特异的化学修饰法

当前150页，总共187页。反应切割碱基修饰修饰碱基的转移DNA链的断裂R1G>A硫酸二甲脂pH7.0加热氢氧化钠R2A>G硫酸二甲脂酸氢氧化钠R3C+T肼六氢吡啶六氢吡啶R4C肼+盐六氢吡啶六氢吡啶R5G硫酸二甲脂六氢吡啶六氢吡啶R6G+A酸酸六氢吡啶R7C+T肼六氢吡啶六氢吡啶R8C肼+盐六氢吡啶六氢吡啶R9A>C氢氧化钠六氢吡啶六氢吡啶R10G>A硫酸二甲脂pH7.0加热六氢吡啶R11G亚甲蓝六氢吡啶六氢吡啶R12T四氧化锇六氢吡啶六氢吡啶3.碱基特异的化学切割法

当前151页，总共187页。4.测序过程

当前152页，总共187页。每组反应只针对特定的碱基，共有4组反应，可分别显示G、A+G、C、C+T的终止位置。特点：读出的序列就是要测的序列。Sanger测序法读出的序列是新合成的互补链序列。当前153页，总共187页。当前154页，总共187页。当前155页，总共187页。测序读片当前156页，总共187页。90年代初期由英国、前南斯拉夫和俄罗斯的4个科学家小组同时提出来的。1.原理

（1）只有完全互补的DNA序列才能杂交形

成完全的双链分子。杂交效率最高。三、DNA杂交测序（2）有个别不互补碱基时，杂交效率下降。（3）非互补碱基越多，杂交效率越差。当前157页，总共187页。（4）用一段寡居聚苷酸（8-mer）的所有可能的碱基排列序列作探针。8mer探针有48=65536种序列。如：8-mer靶DNA同65536中的一种探针完全杂交形成完全互补双链。

（5）根据杂交效率可推断出靶DNA的序列。5’-AGCCTAGC-3’

Target3’-TCGGATCG-5’

Probe假如探针序列已知，则可推知靶DNA序列。

当前158页，总共187页。但：12mer靶DNA与8-mer探针杂交，将会有5种探针与之形成完全互补双链。3’-TCGGATCG-5’

3’-CGGATCGA-5’

3’-GGATCGAC-5’

3’-GATCGACT-5’

3’-ATCGACTT-5’

5’-AGCCTAGCTGAA-3’

12-mertarget8-merprobe假如知道能与之完全杂交的所有5种探针序列，就可推知12bp的靶DNA序列。当前159页，总共187页。（1）DNA芯片（chip）把寡聚核苷酸探针的3‘端或5’端与玻璃或凝胶形成共价连接。目前可以做出65536种8-mer探针芯片。2.技术要点

每种探针的序列和位置已知，可被电脑读出。当前160页，总共187页。当前161页，总共187页。DNAchip杂交当前162页，总共187页。（1）非放射性标记1981年第一台商业化生产的DNA自动测序仪诞生。四、DNA自动化测序荧光物质标记。用激光能激发出不同颜色的荧光。1.技术要点（2）不同的标记对象既可标记引物，也可标记ddNTP。当前163页，总共187页。（4）分析自动化（3）读片的自动化激光探头直接读胶，实时阅读。（2）反应的自动化Sanger脱氧终止法。电脑自动把荧光信号转化成对应的碱基，并打印出DNA序列。（5）反应可在一个试管中进行标记ddNTP时。当前164页，总共187页。2.荧光标记引物的自动化测序①分别用4种荧光物标记引物，②区分反应产物，③混合电泳，④激光一次读胶，⑤电脑合成结果。当前165页，总共187页。当前166页，总共187页。3.荧光标记ddNTP自动测序原理图解4种不同的荧光物分别标记4种ddNTP。当前167页，总共187页。可在同一管中进行当前168页，总共187页。可在单一泳道电泳。当前169页，总共187页。荧光标记终止法测序当前170页，总共187页。测序结果当前171页，总共187页。毛细管测序仪日本开发的世界上最高速DNA测序仪。可同时解析384个样品！标记法：4色荧光、引物标记/终端标记。测序长度：600bp/毛细管6毛细管测序仪日本开发的世界上最高速DNA测序仪。可同时解析384个样品！标记法：4色荧光、引物标记/终端标记。测序长度：600bp/毛细管6当前172页，总共187页。第六节

酵母双杂交系统YeastTwoHybridSystem(Interactiontrap)90年代，纽约大学的S.Field等建立。当前173页，总共187页。双杂交系统的建立是基于对真核生物转录起始过程调控的认识。

GAL4activationdomainLexDNA-bindingdomainGAL1operatorLacZasreporterUASGGAL1operatorLacZasreporterGAL1operatorLacZasreporterLexAenhancer1、真核生物转录激活过程GAL4AD+BD融合蛋白（fusionprotein）

(GAL4AD+LexABD)当前174页，总共187页。GAL1operatorLacZasreporterUASGGAL1operatorLacZasreporterGAL1operatorLacZasreporterLexAβ-galactosidase1800unitsNothing520unitsGAL4GAL4-LexAGAL4+UASGenhancingGAL1LacZNoactivatornoLacZexpressingLexA+LexA.GAL4activation

GAL1LacZexpressingenhancer当前175页，总共187页。（1）转录激活因子在结构上是组件式的(modular)，即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域(DNAbindingdomain,简称为BD)和转录激活结构域(activationdomain,简称为AD)，它们是转录激活因子发挥功能所必需的。FunctionofactivationdomainrecruitmenttheRNApolymerasetopromoter.GAL1ope