检验仪器学第13章核酸扩增

第十三章

PCR核酸扩增仪

(PCRnucleicacidAmplifier)教学基本要求掌握核酸扩增仪的工作原理和主要性能指标。掌握梯度PCR仪和原位PCR仪的功能和特点。掌握实时荧光定量PCR扩增仪的种类及特点。熟悉PCR技术的原理；PCR扩增仪的种类；荧光实时定量PCR（RQ-PCR）技术原理。了解PCR扩增仪的操作规程；PCR扩增仪常见故障的排除；PCR扩增仪的应用。内容提要第一节PCR核酸扩增仪的工作原理第二节PCR核酸扩增仪的分类与结构第三节PCR核酸扩增仪的性能指标、操作规

程及常见故障的排除第四节PCR核酸扩增仪的临床应用第一节PCR核酸扩增仪的工作原理PCR技术的发展简史PCR技术的原理核酸扩增仪的工作原理PCR技术的发展简史

1953年，DNA双螺旋结构被发现1963年，建立了核酸测序的方法

1971年Khorana最早提出核酸体外扩增的设想。PCR技术的发展简史1971年，KjellKleppe等描述的一项基于酶的体外DNA复制实验

。

1985年美国PE公司KaryMullis在开车前去北加利福尼亚红树县的一条被月光笼罩的山路上构思了PCR。1993年，Mullis因此项技术获诺贝尔化学奖。PCR技术的发展简史

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow（克列诺）片段，该片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性，但缺少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。PCR技术的发展简史1988年，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。KeohanogKaryMullisSaikiPCR技术的发展简史PCR技术的原理PCR技术的本质是核酸体外扩增加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板DNA杂交，在TaqDNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复“变性→退火→引物延伸”过程至25～40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。PCR技术的原理PCR循环–

第一步–加热变性PCR技术的原理PCR循环-

第二步–引物与模板DNA分子退火Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’PCR技术的原理PCR循环-

第三步-引物延伸Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerasePCR技术的原理第1个PCR循环完成后

——得到两个拷贝的靶序列PCR技术的原理30次循环后靶序列扩增的数量循环数扩增产物量（2n）1 21＝22 22＝43 23＝84 24＝165 25＝326 26＝6420 220＝1,048,57630 230＝1,073,741,824PCR核酸扩增仪的工作原理PCR核酸扩增仪的工作关键是：温度控制PCR核酸扩增仪的工作原理控温方式离心式空气加热控温

半导体控温

压缩机控温

水浴锅控温

PCR仪的控温方式水浴锅控温：第一代压缩机控温：第二代，金属导热，边缘效应及overshooting和undershooting现象半导体控温和离心式空气加热控温：第三代第二节PCR核酸扩增仪的分类与结构普通定性PCR核酸扩增仪实时荧光定量PCR核酸扩增仪第二节PCR扩增仪的分类与结构PCR扩增仪的种类

原位PCR仪

梯度PCR仪

实时荧光定量PCR扩增仪

普通PCR扩增仪

普通定性PCR核酸扩增仪按照变温方式分为以下三类：水浴式PCR仪变温金属块式PCR仪变温气流式PCR仪

普通定性PCR核酸扩增仪

——水浴式PCR仪一般由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成。采用半导体传感技术、电子技术和计算机技术进行水浴温度的测量、显示和控制并经计算机控制由机械臂完成样品在每个水浴槽的置放以及槽间的移动。特点：仪器体积较大，但变温快、时间准、温度均一，目前国内应用较少。

普通定性PCR核酸扩增仪

——变温金属块式PCR仪中心是由铝块或不锈钢制成的热槽，上有不同数目甚至不同规格的凹孔，用来放置样品管。凹孔内壁加工精密，保证与样品管紧密接触。一般通过半导体加热和冷却，并由微机控制恒温和冷热处理过程，通过键盘和显示器实现人机交流，并可编程、存储或删除程序。特点：仪器装置比较牢固耐用，温度变换平稳，有利于保持TaqDNA聚合酶的活性。普通定性PCR核酸扩增仪

——变温气流式PCR仪由机壳、热源、冷空气泵、控制器及辅助元件等组成。热源由电阻元件和吹风机组成，形成热空气枪借空气作为热传播媒介，由大功率风扇及制冷设备提供外部冷空气制冷，精确的温度传感器构成不同的温度循环。特点：仪器不用金属精密加工，成本较低；整个系统没有液体流动及制冷剂，安全程度高。配上微机和软件，可灵活编程。

普通定性PCR核酸扩增仪按照功能用途可分为以下两类：梯度PCR仪原位PCR仪

普通定性PCR核酸扩增仪

——梯度PCR仪由普通PCR仪衍生出的具温度梯度功能的核酸扩增仪。多种变性温度和延伸温度可在一台扩增仪上同时完成既节省实验时间、提高实验效率，又节约实验成本。梯度PCR仪每个孔的温度可以在指定范围内按照梯度设置，根据扩增结果，一步就可以摸索出最适退火条件。

普通定性PCR核酸扩增仪

——原位PCR仪

是原位杂交与PCR技术的结合。在细胞内进行PCR扩增，而不破坏组织细胞的形态。解决了以往手工方法操作复杂，扩增效果及实验结果重复性不理想的问题。与普通PCR仪的区别：其样品基座上有若干平行的铝槽，每条铝槽内可垂直放置一张载玻片，每张载玻片面均与铝槽紧密接触，温度传导极佳，控温很精确。实时荧光定量PCR核酸扩增仪ABI7500荧光定量PCR仪

MJ公司Chromo4荧光定量PCR仪

Bio-rad公司iCycler荧光定量PCR仪实时荧光定量PCR核酸扩增仪实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR，RQ-PCR)技术是在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号达到定量的目的。实时荧光定量PCR核酸扩增仪实时荧光定量PCR核酸扩增仪由两部分组成：PCR系统和荧光检测系统。荧光检测系统主要包括激发光源和检测器，现在的主流是多色多通道检测，激发通道越多适用的荧光素种类越多，仪器适用范围就越宽。荧光检测（二）荧光检测系统

激发光源

检测器

发光二极管

卤钨灯光源

超低温CCD

光电倍增管实时荧光定量PCR核酸扩增仪金属板式实时荧光定量PCR仪离心式实时荧光定量PCR仪各孔独立控温的定量PCR仪金属板式实时荧光定量PCR仪即传统的96孔板式定量PCR仪，由第三代的半导体PCR仪发展而来，在原位PCR仪的基础上，增加荧光激发和检测模块，升级为荧光定量PCR仪。可作普通PCR仪使用，带梯度功能，但温度均一性差，有边缘效应，标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致。

金属板式实时荧光定量PCR仪激发光源多为卤钨灯，与5色滤光镜配合，可同时激发96或384个样品；检测器为超低温CCD成像系统，可同时多点多色检测，能有效分辨FAM／SYBRGreenI、VIC／JOE、NED／TAMRA／Cy3等多种荧光染料。随机配制的定量PCR引物和探针设计软件PrimerExpress可以设计定量PCR所需的TaqMan探针。有实时动态(Real-Time)和终点读板(PlateRead)两种模式。实时荧光定量PCR核酸扩增仪金属板式实时荧光定量PCR仪离心式实时定量PCR仪

各孔独立控温的荧光定量PCR仪

离心式实时定量PCR仪离心式实时定量PCR仪器的样品槽被设计为离心转子的模样，借助空气加热，转子在腔内旋转，每个样品孔之间的温度差异小于0.01℃，保障了标准曲线和样品之间反应条件的一致性。激发光源大多采用发光二极管(LED)冷光源，运行前无需预热，无需校正。系统误差少，定量线性范围可达l0个数量级。缺点：离心转子小，可容纳样品量少，有的需用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本，也不带梯度功能。

离心式实时定量PCR仪Rotor-Gene3000荧光定量PCR仪

LightCycleTM荧光定量PCR仪

离心式实时定量PCR仪LightCycleTM荧光定量PCR仪结构示意图

实时荧光定量PCR核酸扩增仪金属板式实时荧光定量PCR仪离心式实时定量PCR仪各孔独立控温的荧光定量PCR仪

各孔独立控温的荧光定量PCR仪各孔独立控温的定量PCR仪设计非常独到，不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，各孔独立控温，可以在同一台定量PCR仪上分进行不同条件的定量PCR反应，随时利用空置的样品槽开始其他定量反应，使用效率非常高。升降温速度高达10℃／s，控温精度高。每个模块独立控制的激发光源和检测器直接与反应管壁接触，保证荧光激发和检测不受外界干扰。各孔独立控温的荧光定量PCR仪该类仪器整合多通道光学检测系统，能有效分辨多种荧光染料，可对同一样品进行多靶点分析，同时检测四种荧光信号。可使用Taqman探针、分子信标、Amplifluor引物等多种检测方法，定量线性范围可达9个数量级。其软件允许一台仪器同时操作多个样品模块，既满足高速批量要求，又能灵活运用，还可实现任意梯度反应。缺点：上样不如传统方法方便，而且需要独特的扁平反应管，使用成本较高。适合多指标快速检测，但目前在国内应用尚少。第二节PCR扩增仪的分类与结构SmartCyclerⅡ荧光定量PCR仪第三节PCR核酸扩增仪的性能指标、操作规程

及常见故障的排除PCR核酸扩增仪的性能指标PCR核酸扩增仪的操作规程PCR核酸扩增仪常见故障的排除PCR核酸扩增仪的性能指标性能指标其他

软件功能基座容量和样品数荧光检测

荧光检测范围检测通道数量CT值重复性误差温度控制

温度的均一性升降温的速度不同模式下的相同温度特性热盖温度温度的准确性温度控制温度的准确性是指样品孔温度与设定温度的一致性，是PCR反应最重要的影响因素之一，直接关系到实验的成败。温度的均一性是指样品孔间的温度差异，关系到不同样品孔之间反应结果的一致性。如：“位置的边缘效应”会影响结果的可重复性。升降温的速度升降温速度快，能缩短反应进行的时间，提高工作效率，提高PCR反应特异性。温度控制升降温的速度升降温速度快，能缩短反应进行的时间，提高工作效率，提高PCR反应特异性。

热盖温度热盖可使样品管顶部温度达到105℃左右，避免蒸发而改变PCR反应体积，无需再向反应管内添加石蜡油，减少了后续实验的麻烦。

荧光检测CT值重复性误差

荧光检测范围

检测通道数量

Ct值得重复性误差Ct值得含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系要求Ct值的CV小于或等于2.5%典型“S”型曲线指数起始期、扩增期、平台期三期明显Ct值的意义：扩增达到阈值时的循环数

Ct值与重复性同一样本在相同条件下同时进行96次扩增FQ-PCRCt值与浓度不同的模板达到荧光域值时的Ct值不同荧光检测范围PCR是一个指数级扩增的过程，微量的起始拷贝数不同，经过几十过循环后，其荧光差别将十分巨大。荧光检测要求范围：10-1010检测的通道数量复合PCR实验已成为一种流行趋势，要求仪器具有多通道检测能力。目前的PCR仪4通道检测的居多，部分仪器具有6个检测通道。其他

常用样品管：0.2、0.5mlPCR管；8、12联排管；96孔微孔板等

其他

新型的PCR仪都常规使用优质配套软件，此类软件易学易用，还具有实时信息显示、记忆存储多个程序，及自动倒计时、自动断电保护等功能，很多仪器还可以免费升级。第三节

PCR扩增仪的性能指标

PCR扩增仪的操作规程

PCR扩增仪的常见故障的排除PCR核酸扩增仪的操作规程普通PCR扩增仪的操作非常简便，接通电源，仪器自检，按照程序设置温度或调出储存的程序运行即可。定量PCR扩增仪的操作和普通PCR仪基本相同。第三节

PCR扩增仪的性能指标

PCR扩增仪的操作规程

PCR扩增仪的常见故障的排除PCR核酸扩增仪常见故障的排除荧光染料污染样品孔：请工程师清洁样品孔；PCR管融化：可能是温度传感器出问题或是热盖出问题，需工程师检修；个别孔扩增效率差异很大：可能的原因是半导体模块出现坏点，需工程师检修；PCR核酸扩增仪常见故障的排除荧光强度减弱或不稳定：原因有滤光片发霉或有水汽等，需工程师检修；或光源损耗需更换光源；或需调节检测元件灵敏度，也需工程师调试；仪器工作时出现噪声：可能的原因是PCR管没有放好；或风扇松动，需工程师检修；PCR核酸扩增仪常见故障的排除仪器采集荧光时有不正常的噪声：某些光纤传导信号的定量PCR仪可能出现这一问题，需工程师检修或更换配件；机器搬动后不能正常工作或不能正常采集荧光信号对于某些光路系统复杂的仪器，应尽量避免自行搬动仪器。出现这种情况后需工程师重新调试;PCR反应假阴性原因很多，其中PCR仪控温不准也是一个重要原因，可使用电子测温仪校准温度