第一节核酸的分离纯化

分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因就是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。DNA分子的切割与连接核酸分子杂交凝胶电泳细胞转化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定点突变PCR扩增等核心技术当前1页，总共44页。基因工程诞生的基础1、理论上的三大成就2、技术上的二大发明当前2页，总共44页。三大成就

：1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；1928FrederickGriffith&1944Oswald

AveryTransformationofStreptococcuspneumoniae1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验当前3页，总共44页。2.50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；X-raysourceCrystallizedDNARosalindFranklin拍出了第一张能反映DNA美丽双螺旋结构的X射线照片MauriceWilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&Wilkins当前4页，总共44页。Descriptionofthe3-DstructureofDNAFrancisCrick&JamesWatson三位科学家因为对这一成果的贡献，共享1962年的诺贝尔生物学奖当前5页，总共44页。ConservativeModelSemiconservativeModelFrankStahlMattMeselsonParentcellFirstreplicationSecondreplication1958-MatthewMeselson&FranklinStahlprovedthatDNAreplicationinbacteriafollowsthesemiconservativepathway当前6页，总共44页。3.50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。JacobandMonod当前7页，总共44页。但是，如果没有分离和富集单一DNA分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。

当前8页，总共44页。两大技术保证：1.DNA的体外切割和连接1962年Arber发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了DNA连接酶（DNAligase）当前9页，总共44页。一把特殊的剪刀

—限制性内切酶的发现

阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，

获1978年诺贝尔生理学和医学奖当前10页，总共44页。HerbertBoyer,StanleyCohen1972年获得第一个重组DNA分子(实现不同来源DNA的重组)HerbertBoyer当前11页，总共44页。1972-PaulBergProducedfirstrecombinantDNAusingEcoRIEcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA当前12页，总共44页。1973-Boyer,Cohen&ChangTransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecolonies当前13页，总共44页。2.DNA的核苷酸序列分析技术DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发站起来的一门重要的DNA技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆DNA片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。当前14页，总共44页。Generalprocessofgeneengineering1.从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。2.将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。当前15页，总共44页。5.将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。当前16页，总共44页。

目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线当前17页，总共44页。分（离目的基因）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）

转（化宿主细胞）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）当前18页，总共44页。第一节核酸的分离纯化当前19页，总共44页。主要内容

前言一、核酸分离、纯化原则（一）保持核酸分子一级结构的完整性（二）防止核酸的生物降解二、分离提取核酸的主要步骤（一）细胞的破碎（二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除（三）核酸的沉淀

(四）核酸的浓度测定（五）核酸的保存当前20页，总共44页。

核酸（nucleicacid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。前言当前21页，总共44页。一、核酸分离、纯化原则（一）保持核酸分子一级结构的完整性

1意义遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。

2分离核酸原则：

1）温度不要过高；

2）控制一定的pH值范围(pH值5-9);

3）保持一定的离子强度;

4）减少物理因素对核酸降解的机械剪切力.当前22页，总共44页。（二）防止核酸的生物降解细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。当前23页，总共44页。1DNA酶抑制剂1）金属离子螯合剂：

DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉；2）阴离于型表面活性剂：如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。当前24页，总共44页。2RNA酶（RNAase)抑制剂

RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。

(1)皂土（bentonite

）作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。当前25页，总共44页。

(2)DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)

粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。

作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。

使用注意：

1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。

2）容易降解，保存在4℃或液氮中；

3）提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。

4）剧毒。当前26页，总共44页。（3)肝素（4）复合硅酸盐（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧钒核糖核苷复合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)当前27页，总共44页。二分离提取核酸的主要步骤（一）细胞的破碎

1高速组织捣碎机捣碎

2玻璃匀浆器匀浆

3超声波处理法

4液氮研磨法

5化学处理法(SDS、LDS，吐温80等）

6生化法（溶菌酶、纤维素酶等）当前28页，总共44页。（二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。当前29页，总共44页。常用方法：

1加入浓盐溶液（如NaCl）核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；

2加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；

当前30页，总共44页。

3酚/氯仿抽提

酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。当前31页，总共44页。

1）使用注意酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。

2）安全操作酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。使用酚时应注意当前32页，总共44页。（三）核酸的沉淀沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点：①改变核酸的溶解缓冲液；②重新调整核酸的浓度；③去除溶液中某些盐离子与杂质。当前33页，总共44页。1核酸沉淀的盐类及浓度当前34页，总共44页。2有机沉淀剂

（1）乙醇优点：

对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。缺点：

需要量大，一般要求低温操作。当前35页，总共44页。（2）异丙醇优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。当前36页，总共44页。（3）聚乙二醇（PEG）优点：可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。当前37页，总共44页。（4）精胺

精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。

原理是：精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。当前38页，总共44页。3核酸沉淀的温度和时间一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA样品足可达到实验要求。当前39页，总共44页。(四）核酸的浓度测定

1紫外分光光度法测定DNA和RNA的含量

前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25μg/ml。

结论：在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37μg/ml；RNA为40ug/ml。当前40页，总共44页。DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。

对标准样品来说，浓度为1μg/ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02

当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg/ml

ssDNA浓度约为37μg/ml

RNA浓度约为40μg/ml

当前41