第十三次课单克隆抗体从诊断到治疗详解演示文稿

第十三次课单克隆抗体从诊断到治疗详解演示文稿当前1页，总共53页。（优选）第十三次课单克隆抗体从诊断到治疗当前2页，总共53页。“thespecificityindevelopmentandcontroloftheimmunesystem”andthethediscoveryof“theprincipleforproductionofmonoclonalantibodies”当前3页，总共53页。Natural-SelectionTheoryofantibodyformation（抗体形成过程中的自然选择学说）1955年SomaticGenerationofimmuneRecognition（免疫系统的自我建立学说）1971年

NetworkTheory（免疫系统的相对稳态学说）1974年当前4页，总共53页。免疫相关疾病和生物学过程自身免疫疾病：类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮器官移植：免疫排斥过敏：有机体对某些药物或外界刺激的感受性不正常地增高的现象；过分敏感疫苗：基因重组乙肝疫苗当前5页，总共53页。Tcell在胸腺中经历阳性和阴性筛选过程当前6页，总共53页。当前7页，总共53页。1、多克隆抗体（polyclonalantibody,pAb）：

用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物。

2、单克隆抗体（monoclonalantibodies,mAb）：

由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。当前8页，总共53页。McAbandPcAb当前9页，总共53页。杂交瘤技术的诞生

1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity）1984年度荣获诺贝尔生理学和医学奖当前10页，总共53页。

一、杂交瘤技术的基本原理

聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细

胞与小鼠骨髓瘤细胞融合

HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤

细胞系单克隆抗体生成：接种杂交瘤

细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体当前11页，总共53页。抗体种类：第一代抗体多克隆抗体

（polyclonalantibody)第二代抗体单克隆抗体（monoclonalantibody)第三代抗体基因工程抗体（geneticengineeringantibody)当前12页，总共53页。B淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞：寿命长，单

隆抗体当前13页，总共53页。流程当前14页，总共53页。

不产生Ig的重链和轻链

HGPRT-（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）;TK-（胸腺嘧啶核苷激酶）

与提供淋巴细胞的动物品系相同（一）小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠建立的骨髓瘤细胞系:SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653NSO/1当前15页，总共53页。

动物：BALB/c小鼠4～8周龄20g～25g体重（二）免疫脾细胞当前16页，总共53页。细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫体内免疫法--免疫原性强、来源充分的抗原，对于免疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的抗原就不适用了免疫小鼠当前17页，总共53页。。淋巴细胞当前18页，总共53页。。浆细胞当前19页，总共53页。。抗原接种当前20页，总共53页。免疫原特性抗原量接种次数间隔时间单抗的特性抗体滴度亲和性免疫原性强（如细胞、细菌和病毒等）106-107个细胞或1-10ug2-42-4周高中等至强免疫原性中等10-100ug2-42-4周中等或高中等或强免疫原性弱A.20-400ug2-4随后2-3每月2-3月中等强B.10-50ug其后200-400ug2其后4每月每天中等中等C.10-100ug2其后4其后“休息”最后加强每月10天1-2月中等中等或强表6-1不同免疫抗原的免疫程序（引自刘秀梵，1994）

当前21页，总共53页。培养液：RPM1640培养液DMEM培养液（三）细胞融合当前22页，总共53页。细胞融合剂：PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题当前23页，总共53页。培养骨髓瘤细胞：选择对数生长期的细胞进行传代培养细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：定期用8-AG（8－氮鸟嘌呤）处理细胞，以维持HGPRT-的状态。注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80℃或液氮及干冰中当前24页，总共53页。取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分钟通常每只小鼠1×108-2.5×108个脾细胞，每只大鼠脾脏可得5×108-10×108脾细胞。免疫脾细胞的制备：1×108的淋巴细胞无菌手术当前25页，总共53页。常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞其中巨噬细胞还有清除死亡细胞的作用饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞的纯化

在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞（Feedercells）。饲养细胞：当前26页，总共53页。。饲养细胞当前27页，总共53页。融合方法a、将1×108脾细胞与2×107-5×107骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中，补加不完全培养基至30ml，充分混匀。b、1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净。c、在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀;置40℃水浴中预热。d、用1ml吸管在1分钟左右（最佳时间为45秒）加预热至40℃的50%PEG（PH8.0）1ml，边加边轻轻搅拌。e、用10ml吸管在90秒内加20-30ml预热至37℃的不完全培养基；20-37℃静置10分钟。f、1000r/min5分钟；弃去上清。g、加入5mlHAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。h、分装96孔细胞培养板，每孔；分装24孔板，每孔；然后将培养板置37℃，5%CO2培养箱内培养。i、5天后用HAT培养基换出1/2培养基。j、7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；（第14天后可用普通完全培养基）。l、经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。当前28页，总共53页。10～20天出现克隆HAT筛选杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。融合细胞的早期培养当前29页，总共53页。常用的抗体检测方法：（1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性高，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。用可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）用全菌抗原的ELISA用全细胞抗原的ELISA抗体捕捉ELISA试验ABC-ELISA试验Dot-ELISA试验免疫组化染色法（2）免疫荧光技术间接免疫荧光法活细胞的膜荧光染色（3）间接血凝试验（4）放射免疫测定当前30页，总共53页。HGPRT酶与TK酶：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶胸腺嘧啶核苷激酶（四）杂交瘤细胞的选择性培养应用液：8-氮鸟嘌呤当前31页，总共53页。HAT培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径（D途径）

T（Thymidine）：胸腺嘧啶核苷酸；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA。H和T联合阻断DNA合成的替代途径。当前32页，总共53页。当前33页，总共53页。HAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡。DNA合成的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡。HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径被阻断当前34页，总共53页。SP2/O:HGPRT-，TK-;长命脾细胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)杂交瘤细胞:HGPRT+，TK+;长命骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交瘤细胞当前35页，总共53页。杂交瘤细胞特点：长期生长繁殖利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力当前36页，总共53页。有限稀释法(limitingdilution)

FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）软琼脂平板法(softagarmethod)

二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存当前37页，总共53页。特点：不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法方法：细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含0.5～1个细胞有限稀释法每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。当前38页，总共53页。效率最高价格昂贵FACS（

FluorescenceActivatingCellSorter）当前39页，总共53页。软琼脂平板法(softagarmethod)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃5%CO2温箱中培养10～14天克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养。吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。当前40页，总共53页。配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml)+细胞冻存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培养液，10%DMSO)“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮

保存数年至数十年“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故当前41页，总共53页。防止污染避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡细胞冷冻的意义当前42页，总共53页。（1）单克隆性的确定

包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。A、杂交瘤细胞的染色体分析对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-56；

B、单抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定

免疫扩散ELISAC、单抗纯度的鉴定

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS、等电点聚焦电泳（IEF）及免疫

转印分析（WB）等方法都可用于鉴定单抗的纯度。PAGE、SDS、IEF、WB（三）单克隆抗体的性质鉴定当前43页，总共53页。（2）单抗理化特性的鉴定抗体亲合力是指抗体与抗原或半抗原结合的程度，其高低主要是由抗体和抗原分子的大小、抗体分子结合簇（部）和抗原决定簇之间的立体构型的合适程度决定的。亲合力通常以平均内在结合常数（K）表示。常用的方法有竞争ELISA、非竞争性ELISA 、间接ELISA、间接法夹心ELISA等（3）单抗与相应抗原的反应性测定包括各类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等当前44页，总共53页。

三、单克隆抗体的制备

经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。当前45页，总共53页。（一）单克隆抗体的产生1动物体内诱生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只,

使用的动物当然首选BALB/c小鼠,将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹