荧光寿命测定的现代方法与应用

荧光寿命测定的现代方法与应用第一页，共二十六页，2022年，8月28日七彩的荧光第二页，共二十六页，2022年，8月28日荧光及荧光分光光度计的发展荧光寿命的基本原理荧光寿命测定的现代方法及数据处理测定荧光寿命的一些应用测定荧光寿命的仪器主要内容第三页，共二十六页，2022年，8月28日

Theemissionoflightfromanysubstanceiscalledluminescence.Someofthefirstscientificreportsofluminescenceappearedinthemiddleofthe18thcentury.In1845,Herschelobservedthatanotherwisecolourlesssolutionofquinine(quinineabsorbsintheUVregion)inwateremittedabluecolourundercertaincircumstances.In1852SirG.G.Stokesstudiedthesamecompoundandfoundthattheemittedlighthasalongerwavelengththanthelightabsorbed,theso-calledStokes’shift.(firstdescribedfluorescence)Inthe1920sand1930sJabłońskiinvestigatedpolarizedlightandfluorescenceandwasabletoshowthatthetransitionmomentsinabsorptionandemissionaretwodifferentthings.TheDevelopmentofFluorescence第四页，共二十六页，2022年，8月28日Thefirstfluorescencemicroscopesweredevelopedbetween1911and1913byGermanphysicistsOttoHeimsttandHeinrichLehmannasaspin-offfromtheultravioletinstrument.Itwasn'tuntiltheearly1940sthatAlbertCoonsdevelopedatechniqueforlabelingantibodieswithfluorescentdyes,thusgivingbirthtothefieldofimmunofluorescence.Bytheturnofthetwenty-firstcentury,thefieldoffluorescencemicroscopywasresponsibleforarevolutionincellbiology,couplingthepoweroflivecellimagingtohighlyspecificmultiplelabelingofindividualorganellesandmacromolecularcomplexeswithsyntheticandgeneticallyencodedfluorescentprobes.

TheDevelopmentofFluorescenceMicroscopes

第五页，共二十六页，2022年，8月28日

Basictheoryoffluorescence

Lifetime

Thephotophysicalprocessesthatoccurfromabsorptiontoemissionareoftenshowninaso-calledJabłońskidiagram.第六页，共二十六页，2022年，8月28日第七页，共二十六页，2022年，8月28日

荧光是分子吸收能量后其基态电子S0被激发到单线激发态S1或S2后由第一单线激发态S1回到基态S0时所发生的。

荧光寿命是指分子在单线激发态S1所平均停留的时间，或者说处于激发态S1的分子数目衰减到原来的1/e所经历的时间。

由于荧光现象多发生在纳秒级,这正好是分子运动所发生的时间尺度,因此利用荧光技术可以“看”到许多复杂的分子间作用过程,例如超分子体系中分子间的簇集、固液界面上吸附态高分子的构象重排、蛋白质高级结构的变化等。荧光寿命的概念第八页，共二十六页，2022年，8月28日荧光寿命测定的现代方法

荧光寿命测定的现代方法主要有以下几种，即时间相关单光子记数法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting，TCSPC)

、频闪技术(StrobeTechniques)、相调制法(PhaseModulationMethods)

、条纹相机法(StreakCameras)和上转换法(Upcon-versionMethods)。第九页，共二十六页，2022年，8月28日时间相关单光子记数法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting,TCSPC)

TCSPC是目前主要应用的荧光寿命测定技术，1975年由PTI(PhotonTechnologyInternational)公司首先商品化。此外,EdinburghInstruments、IBH、HORIBA等公司也在生产基于TCSPC的时间分辨荧光光谱仪。

第十页，共二十六页，2022年，8月28日时间相关单光子记数法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting,TCSPC)TCSPC的工作原理如图所示电信号电信号累积电压信号停止工作荧光第十一页，共二十六页，2022年，8月28日以光子数对时间作图可得到如图所示的直方图,此图经过平滑处理得到荧光衰减曲线。时间相关单光子记数法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting,TCSPC)第十二页，共二十六页，2022年，8月28日时间相关单光子记数法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting,TCSPC)

实际测定中,必须调节样品的荧光强度,确保每次激发后最多只有一个荧光光子到达终止光电倍增管。否则会引起“堆积”效应(PileupEffect)。“堆积”效应是指荧光衰减曲线向短寿命一方偏移的现象。

为了避免堆积效应,实际测定时,多道分析仪存储的光子数大致只有光源脉冲数的1%。也就是说,光源100次脉冲,大约只有1次所引发的荧光被检测。第十三页，共二十六页，2022年，8月28日

TCSPC法的突出优点在于灵敏度高、测定结果准确、系统误差小,是目前最流行的荧光寿命测定方法。但是这种方法所用仪器结构复杂、价格昂贵、而且测定速度慢,无法满足某些特殊体系荧光寿命测定的要求。时间相关单光子记数法(Time-CorrelatedSingle-PhotonCounting,TCSPC)第十四页，共二十六页，2022年，8月28日

频闪技术(StrobeTechniques)

频闪技术也叫脉冲取样技术(PulseSam-plingTechniques)，1987年PTI公司将纳秒级频率荧光寿命测定仪商品化。最近PTI公司推出了新一代频闪分时光谱仪。脉冲取样法测定荧光寿命工作原理如下图所示。(a)工作原理图(b)检测时间门与荧光衰减关系示意图第十五页，共二十六页，2022年，8月28日频闪技术(StrobeTechniques)的优缺点：新一代频闪分时光谱仪有着TCSPC的准确性，比相调制测定速度更快，操作也很方便，仪器价格也大大降低。不过脉冲法得到的荧光衰减曲线包含噪音的水平尚无法知道，在数据分析时应当有所估计。频闪技术(StrobeTechniques)第十六页，共二十六页，2022年，8月28日

荧光寿命测定中的数据处理

1、荧光寿命及其含义

假定一个无限窄的脉冲光(δ函数)激发n0

个荧光分子到其激发态,处于激发态的分子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态，两种衰减跃迁速率分别为Γ和knr

，可得到激发态物种的单指数衰减方程。n(t)=n0exp(-t/τ)(1)式中τ为荧光寿命。由于荧光强度正比于衰减的激发态分子数,因此可将上式改写为:I(t)=I0exp(-t/τ)(2)其中I0

是时间为零时的荧光强度。于是,荧光寿命定义为衰减总速率的倒数:τ=(Γ+knr)-1(3)也就是说荧光强度衰减到初始强度的1/e时所需要的时间就是该荧光物种在测定条件下的荧光寿命。实际上用荧光强度的对数对时间作图,直线斜率即为荧光寿命倒数的负值。荧光寿命也可以理解为荧光物种在激发态S1的统计平均停留时间。第十七页，共二十六页，2022年，8月28日

3、卷积积分

实际测定得到的荧光衰减曲线N(tk

)是仪器响应函数L(

tk

)和真实荧光衰减函数I(t)的卷积。即N(tk)=L(tk)Θ

I(t)

第三条曲线是实测荧光强度衰减曲线的拟合函数Nc(tk)。荧光寿命测定中的数据处理时间/ns光子数上图

给出用TCSPC法测得的闪烁体(Scintil-lator)2,5-二苯基-1,3,4-二唑(2,5-diphenyl-1,3,4-oxadiazole,PPD)的荧光强度衰减曲线及其拟合。第十八页，共二十六页，2022年，8月28日

4、数据分析

数据分析的目的在于,通过拟合实验所得荧光衰减曲线,建立一种最能揭示荧光衰减本质、描述衰减过程的理论模型,从而对所研究体系作出深刻的理解。随着时间分辨荧光技术日益发展,人们相继提出了多种荧光衰减数据分析方法。例如:非线性最小二乘法、矩法、Laplace变换法、最大熵法以及正弦变换法等。荧光寿命测定中的数据处理

利用解卷积的办法可得到脉冲响应函数I(t),进而求得描述样品荧光衰减本质的荧光寿命(τ)等有关参量。

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荧光寿命测定的应用

荧光技术分为静态荧光技术和时间分辨荧光技术。静态荧光技术固然重要,但是静态技术给出的只是平均化结果,平均化过程丢掉了有关分子运动的动态信息。所以时间分辨荧光技术较为常用.时间分辨荧光技术的应用:1、可以揭示荧光猝灭是自由扩散控制还是特异性结合控制。2、研究供体和受体间的能量转移时,不仅可以得到能量转移效率,而且可以揭示受体在供体周围的分布形式。3、揭示荧光猝灭是自由扩散控制还是特异性结合控制。4、研究许多分子间或分子内的弱相互作用信息,特别是动态信息。5、对于表面活性剂类两性分子在溶液或界面上的组装、纳米材料在储存过程中的相互聚集、蛋白质或其它大分子在固液界面吸附过程中的构象调整、大分子与大分子,大分子与小分子,大分子与金属离子等相互作用所引起的大分子构象变化以及这种变化发生的程度和部位位等重要问题可能通过时间分辨荧光技术进行深入研究。第二十页，共二十六页，2022年