分子生物学第三章

分子生物学第三章第1页/共30页a)原核生物的复制基因与酶类

Initiatinggenes

dnaBprepriming300kd~20copies/cellhexamerRNApolprimaseforleadingS.dnaCactswithdnaB25kddnaGprimaseforlaggingS.60kd~25(Okazakifragment)monomer

SSB

BindingwithS.S.DNA74kd~300Preventsfromannealingmonomer第2页/共30页Elongatinggenes

dnaE

DNApolymeraseIII(α)140kd~20dnaZ

DNApolymeraseIII(β)52kd~20polADNApolymeraseI109kd~400polBDNApolymeraseII90-120kd~100第3页/共30页缺口酶活化(T4)(E.coli)缺口腺苷化封口连接dAMPTopoisomeraserep

Relaxedprotein(Helicase)D.S.DNA→S.S.DNAATPase1H-bond/2ATPligLigase

HDP

HelixDe-stabilizingProteinNoATPaseactivityBindingS.S.DNAdecreaseTmPreventsfromannealing第4页/共30页

b)DNA聚合酶（DNApolymerase）

PolApolBdnaEdnaZ

109kd120kd>250kd

monomer

klenowfragmentαα+EF-II

+Prokaryote

IIIIII

5’→3’elongation(dNMP)n+xdNTP→(dNMP)n+x+xppi

10dNt/sec1/10ofpolI500dNt/sec

(75,36)KornbergEββhetero-multimer第5页/共30页3’→5’editing

mismatch10-810-3yes

5’→3’exonuclease

smallfragmentrepairNoNo

whendNTPstarved

3’→5’pyro-phospholysis

(焦)yesyesyes

(dNMP)n+xppi→(dNMP)n-x+xdNTP

mutation

lethallethal

10-20mole./E.coli

IIIIII第6页/共30页b;primersite

c;primerterminater

a;templatesited;dNTPsitee;5’→3’repairsite

36kde胰酶75kdabcOHOHpppdppppppppppppOHOHOHDNApolymeraseI第7页/共30页DNApolymeraseIII

activableDNApolIII

DNApolIII(holoEnzyme)

(10subunits,seep665inMolecularbiology)α+α(dnaE)→DNApolIII(pureEnzyme)+EF-II

730nt/sec.

invitro1000nt/sec.Invivoβ+β(dnaZco-polIII)+第8页/共30页C)真核生物DNA复制的特点及聚合酶

●multiplereplicon

Prok.105bp/minEuk.500-5000bp/min13-900kb/perreplicon

●DNApolα+primase(50-60kd)

6-9NtRNAasprimer

例；果蝇5000replicons受精后genomereplication/3min

Replicons扩增到50,000第9页/共30页●DNApolymerase

α(主要酶类)βγ

Maxi.polMini.polNucleiNucleimt120-300kd30-50kd150-300kdpolymerize5’→3’yesyesediting3’→5’NoNoRNAprimerNoNoNoNoDNAprimer

2000-6000mole./cell第10页/共30页3.6DNA复制的调控

第11页/共30页Repressormodel

AntisenseRNAmodel

RNA-2Positivecontrol

0-5550

RNA-2

RnaseHOHDNA

/RNA

primerforDNAreplication

e.g.ColEIplasmid(15-20)Negativecontrol

RNA-2第12页/共30页RNA-1110bp

-555

-4450RNA-2RNA-1RNA-2

110bpD.S.RNARNaseHcan’trecognizeD.S.RNA-1/RNA-2,

can’tactivatetheformationofprimer’s

3’-OH第13页/共30页RNA-10

WhenRNA-2200-360Nt

Rom

geneexpression

RNA-1/RNA-2D.S.repression

RNA-1

/RNA-2

不能形成primer的

3’-OH促进

限制

63aaROP(Romprotein)

RNA-2

只能转录到100-220base,

不能到达“0”原点

不能形成primer

的3’-OH0第14页/共30页

ColEIplasmid(15-20copies)

Preventingoverreplicationmainlybynegativecontrol第15页/共30页因为RNA1与引物RNA分子的相互作用可逆，因此细胞内RNA1的浓度决定了ColE1质粒复制起始频率。负因子rop蛋白能提高RNA1与引物前体的相互作用，从而增加了RNA1的负调控作用。

ColEIplasmid(15-20copies)

Preventingoverreplicationmainlybynegativecontrol第16页/共30页真核细胞DNA复制的调控真核生物细胞的生命周期：G(复制预备期)、S（复制期）、G2（有丝分裂准备期）和M（有丝分裂期）。在三层水平调控：a

细胞生活周期水平调控，是停留在G1期还是进入S期。外部因子或细胞质因子起诱导作用；b

染色体水平调控，不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序进入S期，机理不明；c

复制子水平调控，决定复制起始与否。这一机制与原核生物细胞相似，包括转录激活、复制起始复合物的组装和引物合成等的调控。第17页/共30页3.7Nucleosomereplication

组蛋白的合成在细胞核内与DNA复制同步（现用现造，不积压浪费）oldoctamer是否解离？组蛋白分子是否重新组装成？Octamer的组装是全保留？半保留？随机？第18页/共30页Cellincubationin

C12,N14,H1

Yes!C14,N15,H31hr分离ν-body甲酸饱和的密度梯度离心+++……放射性带第19页/共30页●Oldoctamer/newoctamer在DNA复制的双链上的分布状况（偏袒分布？随机分布？相间分布？）cycloheximide(放线菌酮,蛋白质合成起始抑制剂)生长的细胞（不重新启动Histone合成）电镜图象第20页/共30页DNA复制时,Octamer不离开亲本DNALeadingS.+oldLaggingS.+newNewold第21页/共30页3.8MethylationofDNA(m5CinEukaryote)

第22页/共30页m5C

a)DNA中m5C的特点

●对MspI,HpaII位点的高频修饰

MspIHpaII

CmCGGCCmGG

+HNH

H4153

62OHNNCH3第23页/共30页●m5C的复制

●m5C的分布

含CG序列HpaIICCmGG;MspICmCGG

HhaIGCmGC;ThaICmGCmG

HeaGGCCm;PstICmTGCAG

（启动甲基化酶）（去甲基化）(保持甲基化酶)

（识别半甲基化）CmGCmGGCGCmCmGGC

CGGC

CGGC

CmG

GC

第24页/共30页●Animal

70%ofCGseq.PlantCNGseq.ofNucleiDNA(mtDNA,cpDNAnom5C)●EukaryoteHighrepetitiveseq.frequentm5CStructuregenerarem5C

Clustergenefrequentm5C

Expressinggenerarem5C

Closedgenefrequentm5C

(inGCislandofpromoter)第25页/共30页b)Functionofm5C

细胞分化，组织特化，阶段发育，组织培养过程的脱分化与m5C的相关性（5-氨胞苷去甲基化的作用）

m5C---甲基化是生物自我保护的机制

m5C

的不足基因表达相关

m5C的丰富基因关闭相关

m5C

的程度具有明显的组织，细胞的特异性(时空性)

m5C-----使Z-DN