分子生物学基本技能训练

分子生物学基本技能训练第1页/共74页

电泳层析离心分光光度基因操作其它

分（离目的基因）切（割目的基因和载体）

接（连目的基因和载体）

转（化宿主细胞）

筛（选阳性克隆）表（达目的基因）基本模式“纵向”体系“横向”体系第2页/共74页1理论部分基因工程原理生化技术原理新技术讲座2实验部分分子生物学实验生化技术实验3示教和录像部分实验原理实验技术第3页/共74页基因工程原理第4页/共74页基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA分子。重组DNA质粒DNA基因片段第5页/共74页1972年,P.Berg:构建第一个DNA重组分子1997年,动物克隆:克隆羊多莉1977年，基因工程产品的出现

H.W.Boyer,第一个基因工程产品(SS)1973年,S.S.Cohen:第一个基因克隆实验2001年，人类基因组计划第6页/共74页EcoRIBoyer和Cohen的实验Boyer和Cohen的实验pSC101pR6-5大肠杆菌第7页/共74页pSC101抗四环素pR6-5抗卡那霉素DNA连接酶重组DNA分子EcoRI抗卡那霉素基因第8页/共74页培养平皿卡那霉素基因四环素\卡那霉素基因大肠杆菌四环素平板第9页/共74页抗四环素抗卡那霉素抗四环素\抗卡那霉素第10页/共74页人体生长激素释放激素(SS)抑制和调节多种激素的作用从动物脑中提取:5mg50万只羊脑基因工程9升大肠杆菌培养液第11页/共74页大肠杆菌SS蛋白重组体+SS基因第12页/共74页大肠杆菌SS蛋白重组体+SS基因目的基因基因载体第13页/共74页

目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线第14页/共74页目的基因及载体的分离1目的基因的获取需要克隆的DNA片段：化学合成法

cDNA文库基因组DNA文库聚合酶链式反应分分分第15页/共74页1）化学合成法：较短的基因（60-80bp）用途：PCR引物测序引物定点突变核酸杂交探针第16页/共74页2）基因文库限制性内切酶……克隆、转化、培养、鉴定基因组DNA基因文库第17页/共74页基因组DNA文库限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装第18页/共74页cDNA文库的组建：基因重组反转录酶mRNAcDNA第19页/共74页引物引物3’5’5’5’3）PCR技术基因组第20页/共74页PCR技术的基本过程模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶循环仪94oC5’94℃55℃72℃第21页/共74页2载体DNA的选择功能：

为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。为目的基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。为目的基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。第22页/共74页目的基因整合在宿主细胞染色体DNA中独立于宿主细胞染色体DNA外（独立的复制子功能）基因载体第23页/共74页理想载体的基本条件：可转移性合适的复制位点多克隆位点：广泛、特异选择标志，便于筛选和鉴定分子较小，可容纳较大的外源DNA第24页/共74页质粒噬菌体腺病毒载体逆转录病毒载体……种类：第25页/共74页

存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。

具有自我复制功能。带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。经改造后具有多克隆位点。举例：pBR322质粒质粒第26页/共74页第27页/共74页宿主细胞ori第28页/共74页抗Amp宿主细菌含Amp培养基第29页/共74页多种酶切口多克隆位点限制性内切酶单一酶切口第30页/共74页多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker基因载体第31页/共74页

噬菌体载体50kb+LARALARAEcoRⅠEcoRⅠlacZcI第32页/共74页限制性内切酶酶切切酶切第33页/共74页第34页/共74页限制性内切核酸酶

在特异位点上切割DNA分子分三类，常用为Ⅱ类酶识别序列呈回文对称命名：酶来源的生物名称缩写属名-种名-株名-发现次序第35页/共74页

5’-GAATTC-3’3’-

CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-

CAATTG-5’EcoRⅠ的识别序列HaeⅠ的识别序列第36页/共74页5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’第37页/共74页

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘

3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTT

pAACNNNNN3’3‘NNNNNCAAp

TTGNNNNN5’HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端）第38页/共74页磷酸二酯键的形成DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶目的基因与载体的连接接第39页/共74页

T4-DNA连接酶：T4-噬菌体连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm）≤15℃：15℃/6h；12℃/8h；8℃/12h；第40页/共74页连接方式：

相同粘性末端的连接平头末端的连接不同粘性末端的连接人工粘性末端的连接

第41页/共74页粘端连接CCGGCCGGGGCCGGCC

CGGC

CGGCCGGC

CGGC

CCGG

GGCCHapⅡT4-DNA连接酶第42页/共74页平端连接

AGCT

TCGAAluⅠDNA连接酶AGCTAGCTTCGATCGA第43页/共74页重组体的转化受体细胞转第44页/共74页JM109感受态含氨苄平板Am重组质粒感受态第45页/共74页原核细胞的转化（细菌转化）1)受体细胞的选择限制缺陷型:避免修饰和降解重组缺陷型：避免重组整合转化亲和型：较高的可转化性遗传互补型：利于筛选感染缺陷型：防止感染第46页/共74页2）转化方法CaCl2诱导转化电穿孔PEG介导转化人工体外包装特殊处理受体细胞细胞膜特性改变第47页/共74页CaCl2处理受体细菌50-100mmol/LCaCl2

感受态细菌重组体转入细菌第48页/共74页基因重组转染体外包装噬菌体噬菌体体外包装第49页/共74页3）转化率：转化细胞/细胞总数影响因素：

载体：载体性质、空间结构、分子大小等受体细胞转化过程第50页/共74页含氨苄平板连接目的基因基因载体连接酶转化重组体克隆的筛选与鉴定筛宿主细胞第51页/共74页转化后的克隆群体：第52页/共74页1遗传检测法1）抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板第53页/共74页2）标志补救（ß-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段第54页/共74页X-galLacZ蓝色化合物X-gal第55页/共74页（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶第56页/共74页2电泳检测法凝胶电泳检测加样孔DNAMarker空质粒重组质粒

重组质粒酶切重组质粒的PCR扩增片段第57页/共74页原位杂交3菌落杂交筛选法第58页/共74页4免疫化学检测法放射性抗体检测法滤膜（固定抗体）+第59页/共74页5DNA序列检测ACTGAAGGCT第60页/共74页外源基因在宿主细胞中的表达重组子目的基因的mRNA表达蛋白质大肠杆菌（E.coli）受体细胞表第61页/共74页1E.coli表达体系优势：

一种成熟的基因克隆表达的受体细胞繁殖迅速，培养代谢易于控制易于进行遗传操作和高效表达第62页/共74页不足之处：1）缺乏适当的转录后和翻译后加工机制。2）缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特异性空间结构。3）表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。第63页/共74页2目的基因在E.coli中的高效表达三个因素：

强化蛋白质的生物合成抑制蛋白质的降解恢复蛋白质的空间构象第64页/共74页3目的基因表达产物的检测1）蛋白质的PAGE对照样品Marker第65页/共74页2）表达蛋白生物学功能检测淀粉酶基因表达第66页/共74页4目的蛋白的分离纯化分子筛亲和柱离子交换抗原抗体目的蛋白第67页/共74页基因载体目的基因

质粒噬菌体病毒PCRcDNA人工合成基因文库限制性内切酶有切口的载体有切口的目的基因DNA连接酶

重组体

转化转染体外包装带重组体的宿主细胞

表型筛选电泳法核酸杂交免疫学方法目