第二章之微生物菌种选育

Contents菌种的来源1发酵高产菌种选育2菌种退化和菌种保藏3微生物菌种的扩大培育4第一节菌种的来源担子菌细菌酵母霉菌放线菌菌种一、工业发酵常见微生物细菌醋酸杆菌假单胞菌乳酸菌AddYourTitle大肠杆菌枯草芽孢杆菌棒杆菌、短杆菌酵母菌酿酒酵母异样汉逊氏酵母异样变种假丝酵母属AddYourTitle毕赤氏酵母属汉逊氏酵母属霉菌曲霉属青霉属根霉属毛霉属二、工业微生物来源source1source2source3向菌种保藏机构索取从大自然中分别筛选从发酵制品中分别三、微生物菌种的选择性分别微生物样品的采集微生物样品的富集培育目的菌种的分别目的菌的筛选1234微生物样品的采集微生物样品的富集培育1控制培养基的营养成分2控制培养条件3抑制不需要的菌类目的菌种的分别平板稀释法平板划线法平板划线法b.连续划线分别法分区划线分别法1.稀释平皿分别法平板稀释法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀释b.倾注平皿分别法a.涂布平皿分别法（2）倒平板用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株

羧甲基纤维素钠作培育物抗生素筛选检定菌培育，加上发酵液目的菌的筛选影印平板法筛选目的菌四、重要工业微生物菌种的分别筛选菌株的一些重要指标：（1）菌的养分特征（2）菌的生长温度（3）菌对所接受的设备和生产过程的适应性（4）菌的稳定性（5）菌的产物得率和产物在培育液中的浓度（6）简洁从培育液中回收产物。生产性能抗生素产生菌的筛选Text抗生素产生菌的筛选抑菌圈法稀释法生物自显影法扩散法抑菌圈法生长因子产生菌的筛选产生药理活性化合物菌株的筛选多糖产生菌的筛选自然选育诱变育种杂交育种基因工程育种原生质体融合其次节发酵高产菌种的选育菌种改良物理化学生物遗传基因一、自然选育自然选育在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，选育出优良菌种的过程。诱变育种诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理匀整分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后接受简便、快速和高效的筛选方法，从中选择少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学探讨用。诱变育种的原理诱变育种的理论基础是基因突变生物诱变剂化学诱变剂物理诱变剂紫外线快中子NTGNM噬菌体转座子超净工作台小型X射线衍射仪Co60射线机诱变育种的一般步骤保诱变筛选放大罐试验，中试考查大型投产诱变育种步骤动身菌株的选择制备菌悬液诱变处理突变菌株的筛选(一)动身菌株的选择1．自然界新分别的野生型菌株，对诱变处理较敏感，简洁达到好的效果。2．在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的动身菌株。3．每次诱变处理都有确定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。4．动身菌株起先时可以同时选2～3株，在处理比较后，将更适合的动身菌株留作接着诱变。5．要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作动身诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特殊是高产基因。

(二)处理菌悬液的制备这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培育基的培育，并要离心，洗涤，过滤。带玻璃珠的三角瓶内,加无菌水(三)诱变处理依据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。(四)突变菌株的筛选筛选分初筛和复筛。初筛以快速筛出大量的达到初步要求的分别菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异。

1)养分缺陷型的选育养分缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些养分物质如氨基酸、维生素和碱基等的实力，必需在其基本培育基中加入相应的养分成分才能正常生长的变异株。与养分缺陷型对应的是野生型。与筛选养分缺陷型有关的三类培育基：①基本培育基（MM，minimalmedium）——能满足某一菌种的野生型菌株养分要求的最低成分的合成培育基。②补充培育基（SM，supplementalmedium）——在基本培育基中有针对性地补加某一种或几种养分成分，以满足相应的养分缺陷型菌株生长须要（其他养分缺陷型仍不能生长）的培育基。③完全培育基（CM，completemedium）——可满足该菌各种养分缺陷型菌株养分须要的自然或半合成培育基。筛选养分缺陷型的步骤诱变淘汰野生型检出缺陷型确定生长谱一、诱变方法物理诱变化学诱变二、淘汰野生型抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培育短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入确定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以接受青霉素，酵母可接受制霉菌素。菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。

三、检出缺陷型原理：利用不同菌株在固体基本培育基（MM）和完全培育基（CM）上，生长状况完全不同的特点。缺陷型菌株在CM上生长良好，而在MM上则不生长，而野生型都能生长。具体方法：影印法、点种法、夹层法

(一)影印法此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有确定间隔。

(二)点种法也就是随意法。用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培育，视察其生长状况。此法结果明确，但工作量大。

(三)夹层法先在培育皿上倒一层基本琼脂培育基，凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒一薄层MM琼脂培育基，培育24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培育基，再培育。这时其次批长出的菌落就可能是缺陷型。此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很简洁。四、养分缺陷型的鉴定验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷的因子，即生长谱测定。（1）氨基酸、维生素、核酸碱基三大类养分缺陷的鉴定abcabcabca-氨基酸混合液b-维生素混合液c-核酸水解液（2）单一氨基酸养分缺陷的确定将缺陷型菌株培育后，收集菌体，制备成细胞悬液，与MM培育基(溶化并凉至50℃)混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的6个区间放上不同的养分组合的混合物或吸饱此组合养分物的滤纸圆片。培育后会在某组合区长出，就可测得所需养分。—个平皿测一个菌。原理：抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株都是由于代谢失调所造成的，在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍旧接着不断地合成这一产物。方法：选育结构类似物抗性突变株结构类似物是指一些和微生物体内代谢产物结构相类似的物质，因而能够引起反馈，但是它们不能参与生物合成。目的：主要用于末端产物的积累2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株的筛选在培育基中添加末端产物类似物后，未突变的细胞将由于代谢途径受阻而不能获得生物合成所需的该种末端产物，从而导致细胞死亡。那些对类似物不敏感的突变体，则由于原来受反馈限制的酶的结构，或是酶的合成系统已经发生了变更，它们不再受抑制或阻遏的影响，在类似物充斥的状况下照常能合成该种末端产物。例如，用类似物D-精氨酸选出的谷氨酸棒杆菌的抗反馈突变株可使L-精氨酸的产量得到提高。3）抗性突变菌株的筛选抗生素抗性突变株在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗性突变可提高抗生素产量。抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外，还能提高其它代谢产物的量。条件抗性突变因环境不同，能表现为"野生型"菌株的特性和突变型菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。温度敏感突变常用于提高代谢产物产量致死养分缺陷抗性突变菌株的筛选方法一次性筛选法一次性筛选法就是指在对动身菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。噬菌体抗性菌株耐高温菌株阶梯性筛选法

梯度平板法

基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程三、杂交育种标记标记亲和力亲和力A+B+C-D-A-B-C+D+A+B+C+D+接合两株E.coli的接合电镜照片DNA的转化转导准性生殖四、原生质体融合通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程。原生质体的重组频率已大于1/10，而诱变育种一般仅为百万分之一。五、基因工程育种第三节菌种的退化和菌种的保藏菌种退化1微生物菌种保藏2一、菌种退化是指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征渐渐减退或消逝的现象。（一）引起菌种退化的缘由基因突变连续传代其他因素（二）菌种的复壮使衰退的菌种复原原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的状况下，通过纯种分别和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到复原该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的常常、进行纯种的分别和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。菌种的复壮措施①纯种分别：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。

②通过寄主体内生进步行复壮（如Bacillusthuringiensis的复壮）；

③淘汰已衰退的个体（接受比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。

④接受有效的菌种保藏方法。1）合理的育种；

2）限制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-8~10-9，接受良好的菌种保藏方法，可以削减移种和传代的数）；

3）选择合适的培育条件；

4）接受不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常接受稳定的单核孢子进行接种）；

5）接受有效的菌种保藏方法。（三）防止菌种衰退的方法1.目的：

①存活，不丢失，不污染

②防止优良性状丢失

③随时为生产、科研供应优良菌种

2.原理：选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等），创建降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺养分以及添加爱护剂等）。二、菌种保藏菌连续在培育基上（内）移种种生活态传代培育保藏法连续在活宿主上（内）移种保固体斜面藏湿法半固体琼脂柱方休眠态液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）法干法藏在玻璃管内吸附在合适的载体上3.菌种保藏的方法①低温保藏法

方法：菌种管置4℃冰箱保藏，定时传代

原理：低温下，微生物代谢强度明显下降。

②石蜡油低温保藏法：

橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。③干燥保藏法将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。④真空冷冻干燥法加有爱护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。⑤液氮超低温保藏法将菌种置于