SDSPAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳详解演示文稿

SDSPAGE聚(Ju)丙烯酰胺凝胶电泳详解演示文稿第一页，共六十四页。一、什(Shi)么是SDS？十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate,SDS)是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体（monomer）和分子团（micellae）的混合形式存在。第二页，共六十四页。SDS的作(Zuo)用

破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。第三页，共六十四页。二(Er)、SDS的基本原理（一）蛋白质分子的解聚

样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。第四页，共六十四页。1、SDS

阴离子去污剂

变性剂

助溶性试剂

断裂分子内和分子间(Jian)的氢键

分子去折叠

破坏蛋白质分子的二级和三级结构

第五页，共六十四页。2、强还原剂

巯基乙醇（β-mercaptoethanal）

二硫苏糖(Tang)醇（dithiothreitol，DTT）

使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。第六页，共六十四页。第七页，共六十四页。SDS和还原剂的作用：

（1）分子被解聚或组(Zu)成它们的多肽键

（2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负

电荷的蛋白质-SDS胶束。

（3）蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超

过了蛋白质分子原有的电荷量，消除

了不同分子之间原有的电荷差异。第八页，共六十四页。蛋白质-SDS胶束的特点

（1）形状像一个长椭圆棒

（2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的。

（3）长轴的长度(Du)则与亚基分子量的大小成正比。第九页，共六十四页。胶束在SDS系统中的电泳迁移率不再受蛋白(Bai)质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白(Bai)质或亚基分子量的大小。

当蛋白(Bai)质的分子量在15KD—200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系第十页，共六十四页。3、影响SDS电泳的关键因素

（1）溶液中SDS单体浓度（>1mmol/L)

大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1：1.4

（2）样品缓冲液的离子强度（不(Bu)>0.26)

低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度。

第十一页，共六十四页。（3）二硫键是否完全被还原

当二硫键被彻底还原后(Hou)，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。第十二页，共六十四页。（二）缓冲系统的选择

一般情况下，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白质的分离(Li)和电泳的速度是非常关键的。

第十三页，共六十四页。电泳缓冲液的种类：

1、磷酸缓冲液

2、Tris-醋酸钠缓冲系统

3、咪唑缓冲液系统：

比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速

度要比后者快一倍。

4、尿素系统：

适用分子量低于15KD的蛋白样品(Pin)。

5、Tris-甘氨酸系统：

使用最多的缓冲液

6、Tris-硼酸盐缓冲液：

测定糖蛋白的分子量

第十四页，共六十四页。（三）凝胶浓度的选择

由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后(Hou)SDS-蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。

不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度.

第十五页，共六十四页。第十六页，共六十四页。第十七页，共六十四页。第十八页，共六十四页。第十九页，共六十四页。（四）分子量测定

1、相对迁移率（Rf）

Rf即用每个带的(De)迁移距离除以溴酚蓝前沿的(De)迁移距离得到的(De)。

测量位置应在蛋白带的(De)中央。

蛋白带迁移距离

Rf=————————

溴酚蓝迁移距离

第二十页，共六十四页。蛋白带迁移距离固定前的凝胶长度

Rf=—————————X—————————

干燥(Zao)后的凝胶长度溴酚蓝迁移距离

第二十一页，共六十四页。2、作图

以(Yi)已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐标，Rf为横坐标绘图第二十二页，共六十四页。第二十三页，共六十四页。3、通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标

准曲线上读(Du)出他的分子量

第二十四页，共六十四页。三、去污(Wu)剂的选择

无离子去污(Wu)剂：LubroW；Brij35，Tween

Triton

阳离子去污剂：cetyltrimethylammonium

bromide（CTAB）

cetylpyyridinium（CPC）

阴离子去污剂：SDSdeoxycholate

第二十五页，共六十四页。四(Si)、方法

1、分类

（1）根据对样品的处理方式的不同

还原SDS电泳

非还原SDS电泳

带有烷基化作用的还原SDS电泳

第二十六页，共六十四页。（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同(Tong)

连续电泳

不连续电泳

（3）根据电泳的形式

圆盘电泳

垂直电泳

平板电泳

水平电泳

第二十七页，共六十四页。第二十八页，共六十四页。第二十九页，共六十四页。第三十页，共六十四页。2、操(Cao)作

（1）制备分离胶

（2）制备积层胶(堆积胶）第三十一页，共六十四页。第三十二页，共六十四页。第三十三页，共六十四页。第三十四页，共六十四页。第三十五页，共六十四页。第三十六页，共六十四页。分离胶(Jiao)聚合之后第三十七页，共六十四页。第三十八页，共六十四页。第三十九页，共六十四页。第四十页，共六十四页。第四十一页，共六十四页。第四十二页，共六十四页。第四十三页，共六十四页。（3）加样品

样品的处理

在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可引起以(Yi)下的反应：

蛋白质本身的电荷被屏蔽

氢键断裂

疏水相互作用被取消

多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形第四十四页，共六十四页。①还原SDS处理

当加(Jia)入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。第四十五页，共六十四页。②带有烷基化作用的还原SDS处理

烷基化作用可以(Yi)很好地并经久牢固地保护SH基团，而得到窄的电泳带。

第四十六页，共六十四页。③非还原的SDS处理

许多样品，如生理体液、血清或尿素，一般只需(Xu)用1%SDS在100℃煮沸3分钟，并不需要加还原剂，此时二硫键不能被断裂，蛋白并没有完全被去折叠。

第四十七页，共六十四页。（4）电泳（5）固(Gu)定

第四十八页，共六十四页。（6）染色

考马斯亮蓝（coomassiebrilliantblue）

①R-250

三苯基甲烷(Wan)，红蓝色，每个分子含有两个SO3H基团，偏酸性，和氨基黑一样也是结合在蛋白质的碱性基团上。

第四十九页，共六十四页。第五十页，共六十四页。②G-250

二甲花青(Qing)亮蓝，蓝绿色。第五十一页，共六十四页。第五十二页，共六十四页。银染色

银染的机制是将蛋白带上的硝酸(Suan)银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。

第五十三页，共六十四页。第五十四页，共六十四页。（7）照相，凝胶(Jiao)干燥（8）定量测定

第五十五页，共六十四页。3、电泳过程中的不正常现象

（1）“微笑”现象

指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，说明凝(Ning)胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好。第五十六页，共六十四页。（2）“皱眉”现象

由于垂直电(Dian)泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。

第五十七页，共六十四页。第五十八页，共六十四页。（3）“拖尾”现象

样品溶解