血红蛋白分离提取大题

本文格式为Word版，下载可任意编辑——血红蛋白分离提取大题一、根基学识蛋白质分开和提取的原理,㈠凝胶色谱法（调配色谱法）,1、凝胶：,一些微小多孔的球体（内含大量贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）,2、概念：,根据相对分子质量的大小分开蛋白质的有效方法,3、原理：,一、根基学识蛋白质分开和提取的原理,用凝胶色谱法分开蛋白质时，分子量大的蛋白质A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快,D,4、概括过程,一、根基学识蛋白质分开和提取的原理,相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的举行过程可表示为图中哪一个,B,1、概念：在确定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。,㈡缓冲溶液：,2、作用：

能够抗拒（）对溶液（）的影响，维持PH根本不变。,外界的酸或碱,pH值,3、缓冲溶液的配制,通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调理缓冲剂的（）就可以制得（）使用的缓冲液。,1－2,使用比例,在不同PH范围内,斟酌：说出人体血液中缓冲液。,NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3,磷酸缓冲液，保证血红蛋白的正常布局和功能，便于查看(红色)和科学研究其(活性),4、在本课题中使用的缓冲液？,（三）电泳：,1.概念：,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,2.原理：,①大量重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在确定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分开样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，外形的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分开。,3.类型:,琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。,,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动,琼脂糖凝胶电泳示意图,4、聚丙稀酰胺凝胶电泳,（1）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N，亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状布局的凝胶。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。

为了消释净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中参与SDS。,（2）原理：,SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷区别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。,（3）SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理:,4、聚丙稀酰胺凝胶电泳,使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子外形的差异,,蛋白质的提取和分开一般分为四步：

（1）样品处理：包括洗涤红细胞；

血红蛋白稀释；

离心等操作收集到的血红蛋白溶液。

（2）粗分开：透析除去分子较小的杂质。

（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。

（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。,二、测验操作：样品处理→粗分开→纯化→纯度鉴定,1.血液有哪些成分？,2.你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？,二、测验操作：样品处理→粗分开→纯化→纯度鉴定,学识回想,（一）样品处理,1、红细胞的洗涤：

2、血红蛋白的释放：

3、分开血红蛋白溶液：

4、透析：（如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？）,血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色,在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破碎释放,红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分开出血红蛋白，得到红色通明液体。,装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。,二、测验操作：样品处理→粗分开→纯化→纯度鉴定,分开血红蛋白溶液,有机溶剂无色通明的甲苯层,脂类物质白色脂溶性物质沉淀层,血红蛋白溶液红色通明液体,红细胞破碎物沉淀暗红色沉淀物,透析过程动画演示,练习稳定,1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是A弄清各种蛋白质的空间布局B弄清各种蛋白质的功能C弄清各种蛋白质的合成过程D获得高纯度的蛋白质,2、用凝胶色谱法分开蛋白质的过程中，关于蛋白质的表达，正确的是A相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D二者根本无法对比,3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子外形的差异4、在采血容器中参与柠檬酸钠的目的是A调理pHB维持红细胞的能量供给C防止微生物生长D防止血液凝固,5、一分子血红蛋白最多可携带的O2分子数和CO2分子数分别是A4、2B4、4C2、1D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层依次自上而下是：

有机溶剂脂类物质血红蛋白溶液红细胞破碎物沉淀,（二）凝胶色谱操作纯化,1、凝胶色谱柱的制作：,,二、测验操作：样品处理→粗分开→纯化→纯度鉴定,色谱柱的制作过程：打定材料→加工橡皮塞→安装色谱柱,ＡＣＤ,凝胶色谱柱取长为40cm，内径为1．6cm，有关说法中，正确的是(多项选择)A．一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分开的效果B．凝胶色谱柱过高明过1m，不影响分开的效果C．凝胶色谱柱过矮，那么影响混合物的分开度D．凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大,2、凝胶色谱柱的装填,装配好的凝胶柱,3、样品参与与洗脱调理缓冲液面→参与蛋白质样品→调理缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质,（1）调理缓冲液面：开启下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。

（2）滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时留神不要破坏凝胶面。

（3）样品渗入凝胶床：加样后开启下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。

（4）洗脱：提防参与pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，开启下端出口举行洗脱。

（5）收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分开过程中，假设红色区带平匀一致的移动，说明色谱柱制作告成）（6）留神：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,留神：正确的加样操作是（1）不要触及并破坏凝胶面。（2）贴壁加样。（3）使吸管管口沿管壁环绕移动。,3、样品参与与洗脱调理缓冲液面→参与蛋白质样品→调理缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质,斟酌下面的问题：,让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持布局和功能。,,1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？,2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你举行蛋白质得分开有什么意义？,血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分开时可以通过查看颜色来判断什么时候理应收集洗脱液。这使血红蛋白的分开过程分外直观，大大简化了测验操作。,3、你能描述血红蛋白分开的完整过程吗？,血红蛋白提取和分开的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分开、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；

再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分开；

然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；

结果经聚丙烯酰胺凝胶电泳举行纯度鉴定。,收集得到的纯化后的蛋白,,在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的理由是A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分开效果B、气泡阻碍蛋白质的运动C、气泡与蛋白质发生化学回响D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不精细,A,样品的参与和洗脱的操作不正确的是A．加样前，开启色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B．加样后，开启下端出口，使样品渗入凝胶床内C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D．用吸管提防的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面,A,以下是有关血红蛋白提取和分开的相关操作，其中正确的是（）A．可采集猪血作为测验材料B．用蒸馏水重复洗涤红细胞C．血红蛋白释放后应低速短时间离心D．洗脱液接近色谱柱底端时开头收集流出液,A,三、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳,鉴定血红蛋白纯度。,目的：,查看你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），假设分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的理由。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯真的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,四、测验结果分析与评价,1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得告成吗？你是如何判断的？,由于凝胶是一种半通明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得平匀。此外，还可以参与大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，查看色带移动的处境。假设色带平匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。假设色谱柱展现纹路或是气泡，轻小扣打柱体以消释气泡，消释不了时要重新装柱。,假设凝胶色谱柱装填得很告成、分开操作也正确的话，能领会地看到血红蛋白的红色区带平匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；

假设红色区带歪