细胞工程转基因动物

第一页，共六十七页，2022年，8月28日定义：在基因组中稳定地整合有外源基因的动物称为转基因动物（transgenicanimal）。即导入外源基因，整合到基因组，并稳定遗传意义：利用转基因技术，可以建立人类疾病动物模型、加速动物育种、研究真核生物基因表达调控机理以及在哺乳动物特异组织系统内生产药用蛋白。什么是转基因动物？第二页，共六十七页，2022年，8月28日第三页，共六十七页，2022年，8月28日第四页，共六十七页，2022年，8月28日Histroyoftransgenicanimalproduction1970’sfirsttransgenicmiceviaviralinfection,butnotgermlinetransmission(Jaenisch:1974/1975)1980’s,firsttransgenicmiceviamicroinjection,themostpopulartechnique(Gordon,80,Brinster,Wagner-s,Constantini,81)EScellsforgenetransfer(Evans/Kaufman,Mintz,1980)1985,firsttransgenicrabbits,sheep,pigsandcattle.80-90,commercialtransgenicservices,viatransgenicfacility.1990’s,transgenicfarmanimalcompaniesasbioreactorsandorgandonors.第五页，共六十七页，2022年，8月28日主要内容第一节转基因动物的制备目的基因导入转基因胚胎培养与移植转基因动物的鉴定第二节转基因动物的应用第三节转基因动物存在的问题第六页，共六十七页，2022年，8月28日第一节转基因动物的制备外源目的基因制备外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞选择获得携有目的基因的细胞选择合适的体外培养系统和宿主动物转基因胚胎发育和鉴定筛选所得的转基因动物品系第七页，共六十七页，2022年，8月28日主要方法1基因显微注射法2反转录病毒感染法3精子载体法4胚胎干细胞法5核移植法6受体介导的基因转移一、目的基因的导入目的基因成功导入是转基因动物研究的核心技术。第八页，共六十七页，2022年，8月28日目的基因构建用于转基因的目的基因的要素：Promoter/enhancer–when,where,howmuch启动子/增强子-决定基因何时、何地表达及表达强度Codingsequence–codingthespecificprotein

编码区-编码哪个蛋白采用技术：DNA克隆、重组技术第九页，共六十七页，2022年，8月28日载体的特点克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子。多克隆位点：一种内切酶一个酶切位点，(置换型载体，两个酶切位点，置换片段的两侧)，位于不影响载体复制和表达的DNA序列上。分子量不宜过大，容易分离纯化。筛选标记：报告基因或选择标记基因。第十页，共六十七页，2022年，8月28日Example.Geneconstruct

第十一页，共六十七页，2022年，8月28日目的基因制备内切酶位点设计引物时需加入酶切位点内切酶位点酶切连接第十二页，共六十七页，2022年，8月28日将重组DNA显微注射到动物受精卵中。1基因显微注射法第十三页，共六十七页，2022年，8月28日第十四页，共六十七页，2022年，8月28日显微注射法制备转基因小鼠：受精卵的准备：雌雄鼠交配，收集受精卵。基因导入：将目的基因显微注射到受精卵雄原核内。胚胎移植：体外培养至早期囊胚或桑椹胚，再将其移植入假孕养母子宫内。产出嵌合体小鼠。杂交筛选，获得纯合体转基因小鼠。

第十五页，共六十七页，2022年，8月28日显微注射法的优缺点优点转基因范围广，转移基因大，可达数百Kb，且不含任何病毒基因组片段，安全。缺点整合机制不明确，容易随机整合，多拷贝整合导致转入基因不表达；整合位点随机发生会造成转基因动物的基因组重排、突变、易位缺失等；需显微操作仪，技术性要求强。第十六页，共六十七页，2022年，8月28日

2逆转录病毒感染法第十七页，共六十七页，2022年，8月28日逆转录病毒感染法的原理第十八页，共六十七页，2022年，8月28日逆转录病毒载体的构建过程①提取病毒未整合的环状形式DNA②将环状DNA克隆到适当的载体中③选择适当的酶将病毒结构蛋白编码区切除，或切除非结构蛋白基因④将外源目的基因克隆到载体中⑤转染细胞，测定外源基因的表达

第十九页，共六十七页，2022年，8月28日逆转录病毒载体的类型可复制型载体复制缺陷型载体，复制单个周期，依赖于辅助细胞（包装细胞）。Φ-2细胞株辅助细胞的作用：为病毒提供包装蛋白，决定着病毒效价及其宿主范围。第二十页，共六十七页，2022年，8月28日逆转录病毒制作转基因小鼠小鼠8细胞胚胎制备交配48h后处死，取8-细胞胚胎。酸性泰洛氏液中脱去透明带重组病毒载体转染8细胞胚胎转染8细胞胚胎和辅助细胞共培养24h，桑葚胚晚期或囊胚早期。将胚胎移植到假孕母体子宫内，产出子代。子代经筛选、杂交，获得转基因动物。第二十一页，共六十七页，2022年，8月28日逆转录病毒法的优缺点该法的优点：

基因转移效率高，感染率和整合率高，尤其适用于处于多细胞发育阶段的胚胎。如禽类转入后能稳定遗传，整合机制明确缺点：

这类载体容量有限，只能转移小片段DNA(≤10kb)。缺少调控元件可能影响表达尽管为复制缺陷型，若与整合型辅助表达基因组发生同源重组，可能组装成野生型逆转录病毒。

危险第二十二页，共六十七页，2022年，8月28日3精子载体法原理：

精子吸附DNA，再通过受精作用把目的基因传给子代动物，从而获得转基因动物。精子吸附DNA的方法主要有：

DNA与精子共育法

电穿孔导入法

脂质体转染法

第二十三页，共六十七页，2022年，8月28日4胚胎干细胞方法

为什么胚胎干细胞适用转基因操作？胚胎干细胞(ES)是培养的细胞。具有发育全能性。能通过构建嵌合体而产生有功能的生殖细胞。技术关键外源基因导入后，既能高效稳定表达，又不影响ES细胞的各种功能第二十四页，共六十七页，2022年，8月28日操作过程对ES细胞进行基因操作，将外源目的基因导入ES细胞。把转基因ES细胞移入胚泡期的胚胎。然后将胚胎移植到代孕子宫内，产出子代。子代的部分生殖细胞就是由转基因的ES细胞形成。子代转基因鼠之间进行杂交，子代再配对杂交，就获得了纯合的转基因动物。

第二十五页，共六十七页，2022年，8月28日第二十六页，共六十七页，2022年，8月28日第二十七页，共六十七页，2022年，8月28日第二十八页，共六十七页，2022年，8月28日基因打靶与基因敲除基因打靶：指外源DNA片段上带有受体细胞染色体相应部位的同源序列，导入ES细胞后在同源部位发生定点整合，这种整合是通过同源重组的方式来实现的。基因敲除：如果外源DNA含有突变失活的基因，定点整合后取代原来的同源序列，使ES细胞的该基因失活，即是基因敲除。将这样的ES细胞转入小鼠胚胎，便可得到基因敲除的转基因小鼠。第二十九页，共六十七页，2022年，8月28日5核移植法1997年，克隆羊Dolly。此后，英国罗斯林研究所又与英国PPL公司合作诞生了世界上第一批转基因绵羊Polly。人类凝血因子IX基因。以绵羊转基因胎儿成纤维细胞作核供体，获得了3只转基因绵羊。此法的转基因效率高于原核显微注射法，而且在核移植前可以选择后代的性别，有利于转基因群体的建立，节约时间和费用。

第三十页，共六十七页，2022年，8月28日第三十一页，共六十七页，2022年，8月28日6受体介导法早期胚胎细胞内存在胰岛素受体，使受体介导的基因转移成为可能。1999年，IvanvaM.M构建了一个同时携有胰岛素-多聚赖氨酸基因DNA的构建体。将胚胎与其共培养3小时，发现该重组体可穿过透明带在卵裂球核旁区聚集。优点：不需显微操作，而且使用的运载工具对胚胎无明显毒害作用，为将来的基因治疗提供了一条新途径。

第三十二页，共六十七页，2022年，8月28日转基因胚胎的培养与移植哺乳动物：将处理完毕的转基因受精卵或胚胎，经过短期的体外培养，就可移植到假孕鼠的输卵管中进行发育。注射后的小鼠受精卵的卵周隙，应清晰可辨。鱼类和两栖类：不需移植，体外发育。第三十三页，共六十七页，2022年，8月28日转基因动物外源DNA的检测外源基因的Southern印迹分析

检测基因转录的Northern印迹分析PCR技术

表达产物检测--蛋白质分析检测转移外源DNA荧光蛋白基因第三十四页，共六十七页，2022年，8月28日转GFP的小鼠第三十五页，共六十七页，2022年，8月28日TransgenicFishSalmon,troutCangrowupto6timesfasterthanwildtypefishMosthaveextracopiesofgrowthhormone(GH)gene第三十六页，共六十七页，2022年，8月28日GloFish,originallydevelopedinSingaporeasawaytomonitorwaterpollutionThenormallyblack-andsilverzebrafishwasturnedgreenorredbyinsertingvariousversionoftheGFPgene.第三十七页，共六十七页，2022年，8月28日UsesfortransgenicanimalsGenepharmingXenotransplantationIndustrialFood/FeedModelsystem第二节转基因动物的应用前景第三十八页，共六十七页，2022年，8月28日一、转基因动物在基础性研究中的学术价值1、研究基因的结构和功能启动子和增强子2、研究基因的组织特异性表达3、基因多级调节系统的研究有的目的基因必须在另一基因的表达产物激活后才能表达，从而对目的基因的功能和调节进行研究，这种实验体系就称为基因多级调节系统。4、细胞功能的研究毒素基因+细胞类型特异性的启动子第三十九页，共六十七页，2022年，8月28日转neurogenin1启动子控制之下的β-半乳糖甘酶报告基因的小鼠Trangenicmouseembryoinwhichthepromoterforageneexpressedinneuronalprogenitors(neurogenin1)drivesexpressionofabeta-galactosidasereportergene.Neuralstructuresexpressingthereportertransgenearedarkblue-green.(Dr.AnneCalof)第四十页，共六十七页，2022年，8月28日二、转基因动物在医药领域的应用1、生产药用蛋白（动物生物反应器、乳腺生物反应器）2、进行基因治疗3、在人类组织器官移植中的应用4、病毒性疾病5、建立人类疾病的转基因动物模型第四十一页，共六十七页，2022年，8月28日1基因制药Theuseoftransgenicanimals(andsometimesplants)toproducemedicine.

利用转基因动物生产药品“Turningmilkintomedicine.”第四十二页，共六十七页，2022年，8月28日从理论上说，利用转基因动物制药的成本远比传统的生物制药成本低。瓶颈在于转基因动物的制备。汤姆·纽伯里：“利用动物生产药物，只需向动物、畜棚和挤奶装置投资，而不是不锈钢发酵槽。”利用转基因羊生产“α-1号”抗胰岛素。2000头转基因羊的产量，足够2万到4万人使用。第四十三页，共六十七页，2022年，8月28日乳腺生物反应器也称动物个体乳腺表达系统，使外源基因在动物的乳腺中高效表达并分泌到乳汁中，最终从乳汁中获取目的基因产物。有人形象地将动物生物反应器称为分子农场，它是生产药用蛋白的全新生产模式，已经成为生物技术领域发展的重要方向。如何实现？利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物第四十四页，共六十七页，2022年，8月28日乳腺生物反应器表达载体特点：

启动子在物种间存在相容性，可以交叉使用。表达载体包含类固醇应答元件、TATA盒、核糖体结合位点、转录终止信号和polyA信号等元件。增加5端或3端调控序列的长度，或使用乳蛋白基因的内含子，可提高表达水平。基因表达的位置效应，目前还不能克服。第四十五页，共六十七页，2022年，8月28日动物乳腺生物反应器的研究现状难度高、效率低、时间长和费用高.根本原因在于生产转基因动物效率低和基因表达受“位置效应”影响。表达载体的核心生物元件是一种乳蛋白的基因调控序列。第四十六页，共六十七页，2022年，8月28日2基因治疗基因治疗是通过调控目的基因的表达，抑制、替代或补偿缺陷基因，从而恢复受累细胞、组织或器官的生理功能。β-地中海贫血：将小鼠或人的β-珠蛋白基因注入纯合突变体的小鼠受精卵中，使小鼠的贫血得到了纠正。存在问题：插入突变可能会导致其它疾病产生、外源基因是否表达、如何调控表达以及表达在传代中是否稳定等。第四十七页，共六十七页，2022年，8月28日NatureMedicine15,331-337(2009)

BDNF基因转入有利于老年痴呆症的治疗

Inamyloid-transgenicmice,BDNFgenedelivery,whenadministeredafterdiseaseonset,reversessynapseloss,partiallynormalizesaberrantgeneexpression,improvescellsignalingandrestoreslearningandmemory.Theseoutcomesoccurindependentlyofeffectsonamyloidplaqueload.BDNFtherapeuticdeliverymeritsexplorationasapotentialtherapyforAlzheimer'sdisease.

第四十八页，共六十七页，2022年，8月28日3在人类组织器官移植中的应用排异反应的机理：人的器官组织中糖蛋白的决定簇与其他动物不同。动物的血管内皮上的糖蛋白有一个α1,3-半乳糖，和一个α1,3-岩藻糖，而人体内有天然的抗α1,3-半乳糖抗体。动物和人之间器官移植时，人α1,3-半乳糖抗体与动物抗原结合，形成抗原抗体免疫复合物，激活补体系统，损坏器官内皮和基底膜，使渗透性增加、出血，导致器官组织坏死而排斥这种器官。第四十九页，共六十七页，2022年，8月28日解决异种移植中排斥反应的两条途径：一是清除受体动物血中的特定补体，使供体器官不受补体攻击。二是采用转基因技术，通过克隆受体的补体调节蛋白基因，将这种基因转移到供体动物的基因组中，使其在心血管内皮表达，以避免受体的排斥反应。第五十页，共六十七页，2022年，8月28日4病毒性疾病把病毒基因导入动物并制成转基因动物，可研究这些病毒基因在宿主动物引起的病理变化，从而探讨其发病机理和治疗路线。这是转基因动物技术提供的又一条独特的实验体系。

第五十一页，共六十七页，2022年，8月28日5建立人类疾病的转基因动物模型理想的动物模型，可以模拟人类疾病的发生和发展过程，并为测试各种可能的治疗方案提供一个统一有效的系统。用于建立遗传病动物模型，研究单个基因在遗传中的作用，研究药物干预后动物反应机理等。第五十二页，共六十七页，2022年，8月28日基因激活表达生物发光研究者可通过观察动物模型的生物发光，判断靶基因是否表达，即基因的“开”“关”现象。转基因动物模型原理第五十三页，共六十七页，2022年，8月28日血管内皮细胞生长因子受体2（Vascularendothelialcellgrowthfactorreceptor2,VEGFR2）是VEGF的同源受体，VEGF在血管生成过程中分泌。Vegfr2-luc转基因小鼠应用从小鼠VEGFR2基因启动子及内皮细胞特异的增强子共4.5kb，以驱动荧光素酶表达。

第五十四页，共六十七页，2022年，8月28日通过观察发育过程中,VEGFR2-Luc转基因小鼠的VEGFR2表达逐渐降低,研究生物体发育过程信号强度第五十五页，共六十七页，2022年，8月28日已知，VEGFR2启动子活性在肿瘤坏死区域的血管内皮细胞中可被上调。Vegfr2-luc报告基因的活性可在皮肤创伤治愈过程中被诱导及在肿瘤特异的新血管形成中有潜在功能。VEGFR-2在伤口愈合过程中的诱导表达生物发光强度第五十六页，共六十七页，2022年，8月28日科学家培育的小鼠“乙肝病毒携带者”闻玉梅院士，培育转“中国特色”的乙肝B型病毒基因小鼠，已稳定繁殖了7代，可持续表达乙肝病毒表面抗原。这一动物模型的建立，对研究和治疗我国为数巨大的乙肝病毒携带者具有重要意义。“推鼠及人”，身价不菲的黑猩猩。乙肝病毒分为7种不同亚型，我国以B型、C型居多。第五十七页，共六十七页，2022年，8月28日三、转基因动物在畜牧渔业生产中的应用

(一)提高动物的抗逆性

抗冻、耐低溶解氧、抗病毒等。(二)提高动物的产量超级小鼠、超级鱼等。第五十八页，共六十七页，2022年，8月28日第三节转基因动物研究存在的问题技术性问题：一转基因动物的阳性率和总效率都很低二转基因动物与预