第七章发酵生产的染菌及防治

第七章发酵生产的染菌及防治第一页，共九十七页，2022年，8月28日绪论 发酵染菌指在发酵过程中除了生产菌以外，还有其它微生物浸入发酵系统生长繁殖，影响了纯种培养过程。据报道内青霉素发酵染菌率为2%，链霉素、红霉素、四环素发酵的染菌率为5%，谷氨酸发酵噬菌体感染率为1%~2%。染菌对发酵过程有重大的影响，进而影响到发酵产率、提取率、得率、产品质量、三废处理等。 在现有的科学技术条件下要做到完全不染菌是不可能。目前要做的是要提高生产技术水平，强化生产过程管理，防止发酵染菌的发生。如发生染菌，应尽快找出污染的原因，并采取相应的有效措施，把发酵染菌造成的损失降低到最小。第二页，共九十七页，2022年，8月28日1、染菌对发酵的影响种子染菌发酵染菌(发酵前、中、后）2、染菌检查判断镜检肉汤培养平板/斜面培养第三页，共九十七页，2022年，8月28日3、染菌原因分析

菌体生长缓慢

种子培养异常菌丝结团泡沫多异常现象代谢不正常

发酵异常菌体生长差

PH过高或过低溶解氧异常菌浓过高或过低第四页，共九十七页，2022年，8月28日4、常见染菌类型青霉素细短产气杆菌、粗大产气杆菌链霉素细短杆菌、假单孢杆菌、产气杆菌、粗大产气杆菌四环素双球菌、芽孢杆菌、夹膜杆菌柠檬酸

青霉菌谷氨酸噬菌体酒类发酵醋酸菌、乳酸菌规模：大量罐染菌，个别连续染菌、部分罐染菌第五页，共九十七页，2022年，8月28日无菌室沙土管，试管种子带菌培养基空气带菌污染途径操作失误设备噬菌体种子培养期：灭菌或弃之染菌挽救发酵前期：灭菌后补加种子或分罐中、后期：加杀菌剂或抗生素、通风搅拌设备用120℃30min杀菌第六页，共九十七页，2022年，8月28日6、污染不同种类和性质的微生物的影响 生产不同的品种，可污染不同种类和性质的微生物。不同污染时间，不同污染途径，污染不同菌量，不同培养基和培养条件又可产生不同后果。第七页，共九十七页，2022年，8月28日6.1、噬菌体的污染与防止感染途径：

三个必要条件

环境带菌、环境带活菌、噬菌体与活菌接触防止措施：（1）、以环境净化为中心（2）、以“种”为中心（3）、以空气净化系统为中心（4）、以设备、管道为中心（5）、以管理为中心、轮换使用菌种Phage的主要生物学特征:（1）具有专一的寄主性，在菌体繁殖的情况下繁殖（2）不耐热性，700C以上其基本失（3）pH稳定性pH大于10，pH小于5Phage急剧失活（4）不耐药性（5）对干燥的稳定性第八页，共九十七页，2022年，8月28日第九页，共九十七页，2022年，8月28日6.2污染其它杂菌

有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。

有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。

第十页，共九十七页，2022年，8月28日

大罐染菌的挽救1、发酵前期；灭噬、易种法、用抗性菌2、发酵中期：易种、并罐3、发酵后期：实消放罐噬菌体的检测1、单层噬菌斑法2、双层噬菌斑3、平板交叉划线法4、快速检查法5、液体培养检查法事前分别配制2%和1%琼脂的两种培养基，将2%的培养机作底层，铺成平板待用，用生理盐水洗下生长旺盛的细菌斜面，配制菌悬液。取此0.2ml和被测定的Phage液or待检样品液0.1ml于试管中，加入冷却至450C的含1%的琼脂培养基3~4ml混匀后立即倒在2%的培养基平板上，保温培养16~20hr，如有Phage，在上层出现透明无菌的圆形or近圆形空斑。将Phage和菌悬液与含有0.5~0.8%琼脂的培养基混合，在无菌载波片上凝固，经过培养后在镜检计数。用500ml三角瓶加50ml一级种子培养基，经灭菌后，接入0.5~1ml需检查之发酵液或种子液，置于摇床上培养10~12hr,观察液体浑浊度。若浑浊度OD正常，镜检无染菌，正常。若液体清，说明感染。第十一页，共九十七页，2022年，8月28日一、染菌对不同发酵过程的影响

由于各种发酵过程所用的微生物菌种、培养基以及发酵的条件、产物的性质不同，染菌造成的危害程度也不同。如：青霉素的发酵过程核苷或核苷酸的发酵过程柠檬酸等有机酸的发酵过程谷氨酸的发酵过程

第一节染菌对发酵的影响 染菌对发酵过程的影响很大，但由于生产的产品不同、污染杂菌的种类和性质不同、染菌发生的时间不同以及染菌的途径和程度不同，染菌造成的危害及后果不同。T4噬菌体细菌第十二页，共九十七页，2022年，8月28日一、染菌对不同发酵过程的影响（续）：

放线菌由于生长的最适pH为7左右，因此染细菌为多，而霉菌生长pH为5左右，因此染酵母菌为多。（1）抗生素：青霉素生产中污染产青霉素酶的杂菌（自身产生或诱导产生），在发酵过程中，都会使青霉素迅速分解破坏，使目的产物得率降低，危害十分严重。一般污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大。链霉素（污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大杆菌的危害大）、四环素（污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大）、红霉素、卡那霉素等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成不同程度的危害。灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。

第十三页，共九十七页，2022年，8月28日（2）核苷或核苷酸发酵过程：因生产菌多为营养缺陷型微生物，其生长能力差，所需的培养基营养丰富，易受到杂菌的污染，且染菌后，培养基中的营养成分迅速被消耗，严重抑制了生产菌的生长和代谢产物的生成，污染芽孢杆菌的危害最大。

（3）柠檬酸等有机酸发酵过程：一般在产酸后发酵液的pH值比较低，杂菌生长十分困难，在发酵中、后期不太会发生染菌，主要是要预防发酵前期染菌，最怕污染青霉菌。（4）谷氨酸发酵：周期短，生产菌繁殖快，培养基不太丰富，一般较少污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨酸发酵的影响较大。（5）疫苗：多采用深层培养，是不经提纯直接使用的产品，在其培养过程中，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。第十四页，共九十七页，2022年，8月28日三、染菌发生的不同时间对发酵的影响污染时间：是指用无菌检测方法能检测到的污染时间（因为杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁殖的时间才能显现出来），不是杂菌浸入发酵系统的时间。显现的时间又与污染菌量有关。3.1、种子培养期染菌种子培养期（主要是细胞生长繁殖期）：微生物菌体浓度低、培养基营养十分丰富、培养液中几乎没有抗生素（产物）或只有很少抗生素（产物），故比较容易染菌，。措施：一旦发现种子受到杂菌的污染，应经灭菌后弃去，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。第十五页，共九十七页，2022年，8月28日3.2、发酵前期染菌

杂菌与生产菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁殖和产物的形成，发酵前期最易染菌，且危害最大。措施：可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。第十六页，共九十七页，2022年，8月28日3.3、发酵中期染菌

严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成。较严重影响发酵液理化性质，如杂菌大量产酸，pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。措施降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。第十七页，共九十七页，2022年，8月28日3.4、发酵后期染菌发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。如杂菌量不大，可继续发酵。如污染严重，可采取措施提前放罐第十八页，共九十七页，2022年，8月28日四、不同染菌途径对发酵的影响种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有延续性空气带菌：空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事件，不具有延续性设备渗漏：这种途径造成染菌的危害性较大第十九页，共九十七页，2022年，8月28日五、染菌对产物提取和产品质量的影响（1）对过滤的影响发酵液的粘度加大（菌体自溶、发酵不彻底）。造成过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡；大幅度降低过滤收率。（2）对提取的影响溶媒萃取：易发生乳化离子交换：预处理分离不彻底的胶体物质（水溶性蛋白质等）易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量，洗脱时易混入产品中。第二十页，共九十七页，2022年，8月28日（3）对产品质量的影响因含有较多分离不彻底的蛋白质等物质，对产品的纯度有较大影响，同时会使产品放置一段时间后增大出现混浊的可能，影响产品的外观。六、染菌对三废处理的影响使过滤后的废菌体无法利用，发酵染菌的废液，生物需氧量（BOD）增高，增加三废治理费用和时间。第二十一页，共九十七页，2022年，8月28日第二节发酵异常现象及原因分析一、种子培养和发酵的异常现象发酵过程中的种子培养和发酵的异常现象是指发酵过程中某些物理参数、化学参数或生物参数发生与原有规律不同的改变，这些改变必然影响发酵水平，使生产蒙受损失。1、种子培养异常（表现为培养的种子质量不合格）：菌体生长缓慢；菌丝结团；代谢不正常。2、发酵异常：菌体生长差；pH值过高或过低；溶解氧水平异常；泡沫过多；菌体浓度过高或过低；菌体生长差。第二十二页，共九十七页，2022年，8月28日谷氨酸发酵时正常和异常的溶氧曲线噬菌体第二十三页，共九十七页，2022年，8月28日二、染菌的检查和判断1、检查的目的、意义以无菌试验的结果较可靠、迅速的判断染菌，以及时采取处理措施。每个工序或经一定时间都应进行取样检查。无菌试验的目的：（1）监测培养基、发酵罐及附属设备灭菌是否彻底（2）监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入，生产过程中是否存在染菌的隐患和死角2、生产上常用的检查方法有：①显微镜检查（简便、快速，能及时发现杂菌，但镜捡取样少，观察面也小，则不易捡出早期杂菌）；②平板划线检查；③肉汤培养检查。（后两种操作较繁琐（需过夜培养），但能捡出比前者更少的杂菌，结果为主要依据）第二十四页，共九十七页，2022年，8月28日表8-1发酵过程的杂菌检查

除了上述方法外，还对参数的变化情况进行实时监控，以参数的异常变化来判断是否染菌。第二十五页，共九十七页，2022年，8月28日3、发酵染菌率计算基准总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与总投料批（次）数之比的百分率。染菌批次数应包括染菌后培养基经重新灭菌，又再次染菌的批次数在内。是我国的统一的习惯计算方法总染菌率%=还用设备染菌率（统计发酵罐或其他设备的染菌率）、不同品种发酵的染菌率、不同发酵阶段的染菌率、季节染菌率、操作染菌率等统计，以很好地控制生产。第二十六页，共九十七页，2022年，8月28日1、例如：表8-2日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析项目百分率%种子带菌或怀疑种子带菌9.64接种时罐压跌零0.19培养基灭菌不透0.79总空气系统有菌19.96泡沫冒顶0.48夹套穿孔12.36盘管穿孔5.89接种管穿孔0.39阀门渗漏1.45搅拌轴密封渗漏2.09罐盖漏1.54其它设备渗漏10.13操作原因10.15

原因不明24.94三、染菌原因第二十七页，共九十七页，2022年，8月28日表6-3国内一制药厂染菌原因分析

项目百分率%种子带菌14.15盘管穿孔14.20阀门渗漏23.30空气系统有菌10.0管理不善25.80原因不明5.78其它7.49第二十八页，共九十七页，2022年，8月28日管理不善而染菌的有31个罐批，占25.08％经分析有下表所列原因：

项目百分率%进罐前未做设备严密度检查25.8接种违反操作规程25.8检修质量缺乏验收制度19.35操作不熟练19.35配料违反工艺规程6.45调度不当3.25表8-4管理不善染菌的原因第二十九页，共九十七页，2022年，8月28日表8-5国内一抗生素生产厂链霉素发酵染菌原因分析

项目百分率%外界带入杂菌（取样、补料）8.20设备穿孔7.60空气系统有菌26.00停电罐压跌零1.60接种11.00蒸汽压力不足或蒸汽量不足0.60管理问题7.80操作违反规程1.60种子带菌0.60原因不明35.00第三十页，共九十七页，2022年，8月28日2、造成染菌的主要原因总结（1）种子带菌-P233

种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。第三十一页，共九十七页，2022年，8月28日（2）、空气带菌-P233

无菌空气带菌是发酵染菌的主要原因之一（19.96％，26%）。国内外空气除菌技术虽已有较大改善，但仍然没有使染菌率降低到理想的程度。因为空气除菌系统较为复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空气除菌失败。（3）、设备渗漏-P234设备渗漏包括冷却夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。（33.85％，37.5％）。所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查。第三十二页，共九十七页，2022年，8月28日（4）、灭菌不彻底灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系蒸汽通入培养基，升温快慢、保温时间蒸汽总压是否达到要求标准环境中的杂菌数量因季节而有很大差别原材料储存和保管，如玉米浆、母液糖等有机原料——杂菌的数量发酵罐、培养基配制罐等设备的清洗质量——有无灭菌的死角第三十三页，共九十七页，2022年，8月28日（5）、生产技术管理不善技术管理就是要对发酵每个环节严格控制，必须制定严格工艺卫生管理制度。否则发酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有侥幸心理而放松管理第三十四页，共九十七页，2022年，8月28日四、发酵染菌原因分析1、染菌的杂菌种类分析杂菌原因耐热的芽孢杆菌培养基或设备灭菌不彻底、设备存在死角等球菌、酵母、无芽孢杆菌等种子带菌、空气过滤效率低、除菌不彻底、发酵罐的冷却管或加套等设备渗漏、操作问题等真菌无菌室灭菌不彻底、无菌操作不当、灭菌不彻底等表8-6染菌的杂菌种类分析第三十五页，共九十七页，2022年，8月28日2、发酵染菌的规模分析染菌时期原因发酵前期种子带菌、连消设备染菌发酵中、后期如杂菌类型相同，一般是空气净化系统存在空气系统结构不合理、空气过滤介质失效或效率下降等问题表8-7大批量发酵罐染菌（情况较少，危害较大）第三十六页，共九十七页，2022年，8月28日表8-8部分发酵罐染菌

染菌时期原因发酵前期种子带菌、灭菌不彻底发酵后期中间补料染菌，如补料液带菌、补料管渗漏，或油管系统发生问题个别发酵罐连续染菌（如果采用间歇灭菌工艺，一般不会发生）：大都由于设备渗漏造成（设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象，），应仔细检查阀门、罐体或罐器是否清洁等。第三十七页，共九十七页，2022年，8月28日3、不同污染时间分析

（1）、染菌发生在种子培养阶段，或称种子培养期染菌。通常是由种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及接种操作不当或设备因素等原因而引起染菌。（2）在发酵过程的初始阶段发生染菌，或称发酵前期染菌。大部分也是由于种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及接种操作不当或设备因素、无菌空气等原因而引起。（3）发酵后期染菌大部分是由空气过滤不彻底、中间补料染菌、设备渗漏、泡沫顶盖以及操作问题而引起。第三十八页，共九十七页，2022年，8月28日第三节发酵过程染菌的防止一、种子带菌的原因及防止1、带菌的原因（1）无菌室的无菌条件不符合要求；（2）培养基及用具灭菌不彻底；（3）操作不当（移接、培养过程中受污染）。2、种子带菌的防治（1）无菌室和摇床间都要保持清洁。无菌室内要供给恒温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以灭菌，或用化学药品灭菌。第三十九页，共九十七页，2022年，8月28日无菌室要求接种、移种等无菌操作需要在无菌室内进行。无菌室面积不宜过大，一般约4~6m2高约2.6米。为了减少外界空气的侵入，无菌室要有1~3个套间(缓冲过道)(参照下图)。无菌室内部的墙壁、天花板要涂白漆或采用瓷砖，要求无裂缝，墙角最好做成圆弧形，便于揩擦清洗以减少空气中微生物的潜伏场所，室内布置应尽量简单，最好能安装空气调节装置，通入无菌空气并调节室内的温湿度。

在无菌室中装有紫外灯，打开紫外灯，照半小时，关灯后15分钟再接种。用消毒药水如新洁而灭配成1/1000浓度擦桌子、拖地，开启超净台的通风，接种时必须在超净台上操作，超净台装有一台鼓风机，进风口有一粗过滤器，出风口有高效过滤器，保证无菌风从超净台吹出，外界有菌空气不可能进入接种区域，保证无菌条件。接种人员必须穿好无菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干净。第四十页，共九十七页，2022年，8月28日 无菌室内无菌度的要求是：把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放置30分钟，根据一般工厂的经验，长出的菌落在3个以下为好。在种子的无菌条件不要求很高的情况下，可以不采用无菌室而直接用无菌箱进行操作，但无菌要求很高的情况下，即使在无菌室内还要用无菌箱操作。第四十一页，共九十七页，2022年，8月28日（2）在制备种子时对砂土管、斜面、三角瓶及摇瓶均严格进行管理（3）对每一级种子的培养物均应进行严格的无菌检查（4）对菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理第四十二页，共九十七页，2022年，8月28日二、空气带菌及其防治必须从空气的净化工艺和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。1、加强生产环境的卫生管理，减少生产环境中空气的含菌量。2、设计合理的空气预处理工艺，尽可能减少生产环境中空气带油、水量，提高进入过滤器的空气温度，降低空气的相对湿度，保持过滤介质的干燥状态，防止空气冷却器漏水，防止冷却水进入空气系统等。第四十三页，共九十七页，2022年，8月28日3、设计和安装合理的空气过滤器，防止过滤器失效。选用除菌效率高的过滤介质，在过滤器灭菌时要防止过滤介质被冲翻而造成短路，防止过滤介质的装填不均而使空气走短路，保证一定的介质充填密度。在操作中要防止空气压力的剧变和流速的急增。第四十四页，共九十七页，2022年，8月28日三、操作失误导致染菌及其防治淀粉质原料容易结块“夹生”搅拌混合或加入一定量的α-淀粉酶或罐外预先配料混均灭菌时压力表显示“假压”打开排气阀门及有关联接管的边阀、压力表接管边阀等排汽培养基灭菌中产生泡沫添加消泡剂工人操作不当加强技术培训和责任心教育第四十五页，共九十七页，2022年，8月28日四、设备渗漏或“死角”造成的染菌及其防治发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化学腐蚀，物料与设备摩擦造成机械磨损以及加工制作不良等原因会导致设备及附件形成微小漏孔所发生的渗漏现象。1、发酵罐的渗漏（1）冷却管的渗漏是发酵罐中最容易渗漏的部件之一，气压试验和水压试验（2）罐体的穿孔

每年大修时需检查钢板减簿的程度。有夹套的发酵罐可在夹套内用水压或气压的试验方法检查罐壁有无渗漏。发酵罐罐底脓疱状积垢罐底的加强板第四十六页，共九十七页，2022年，8月28日2、管件的渗漏（1）阀据统计，因阀的渗漏引起的染菌占染菌率的比例很大，采用密封性较高的阀门。目前使用的大小阀门大多采用截止阀和橡胶隔膜阀。

1)严密不漏。2)无填料。3)阀结构为流线型，流量大，阻力小，无死角，无堆积物，在关闭时不会使紧密面轧坏。4)检修方便。但须定期检查隔膜有否老化及脱落。

第四十七页，共九十七页，2022年，8月28日2、管路的连接管子的连接有螺纹连接、法兰连接和焊接三种。3、管路的配置排气管与下水管第四十八页，共九十七页，2022年，8月28日第四十九页，共九十七页，2022年，8月28日4、发酵罐与管件的死角所谓死角是指灭菌时因某些原因使灭菌温度达不到或不易达到的局部地区。（1）法兰连接的死角法兰的“死角”a—垫圈内径过小；b—垫圈内径过大；c—法兰不平造成的泄漏与“死角”第五十页，共九十七页，2022年，8月28日（2）渣滓在罐底与用环式空气分布管所形成的死角图A图B图C第五十一页，共九十七页，2022年，8月28日（3）不锈钢衬里的死角小型发酵罐通常采用不锈钢制造。对于大型发酵罐，一般都采用不锈钢衬里的方法。可采用复合钢板(将两种不同材质的钢板轧合为一体的钢板)制造发酵罐。不锈钢衬里破裂造成“死角”第五十二页，共九十七页，2022年，8月28日(4)接种罐管路的死角灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法第五十三页，共九十七页，2022年，8月28日(6)压力表安装不合理形成的死角

另外，须注意罐内结垢形成的死角，对于不锈钢罐及普通碳钢罐的处理不同。压力表安装不合理形成“死角”1,6—发酵罐；2—缓冲管；3,4—压力表；5—旋塞第五十四页，共九十七页，2022年，8月28日5、设备与管道的清洗与杀菌管件和阀门清洗清水漂洗5～10min常温洗涤剂洗涤15～20min常温～70℃清洗漂洗常温5～10min消毒剂处理15～20min常温清水漂洗(15～20min，常温)第五十五页，共九十七页，2022年，8月28日CIP清洗系统定义：

CIP，是英文Clean-In-Place的缩写，即就地清洗或称为原位清洗,其定义为不拆卸设备或元件,在密闭的条件下,用一定温度和浓度的清洗液对清洗装置加以强力作用,使与食品接触的表面洗净和杀菌的方法。第五十六页，共九十七页，2022年，8月28日与传统的手工拆卸机器零件的清洗方式相比,CIP的优点主要有:(1)能维持一定的清洗效果,保证产品的安全性。

(2)节约操作时间、提高效率,以实现商业的最大利润。

(3)节省劳动力,保证操作的安全性。

(4)节省清洗用水和蒸汽。相比之下,常规拆卸清洗的缺点是:费时、费力,易损坏联接件;设备停机时间长,设备利用率低;清洗不彻底,有时对操作者也不十分安全。

CIP的优点第五十七页，共九十七页，2022年，8月28日清洗程序分7个步骤：

㈠预冲洗：30s，10次；㈡碱预洗：16分；㈢中间清洗：清水4分；㈣清水喷冲：3次，每次30S；㈤碱喷冲：15分；㈥清水冲洗；㈦酸性水冲洗。第五十八页，共九十七页，2022年，8月28日6、设备及管路的杀菌发酵罐及容器的杀菌过程容器的气密性试验，打开所有的冷凝水排除阀，开启进蒸汽阀。一定压强后，打开排空气阀，把容器中原有的空气排除干净。当罐内压强升至0.1MPa(121℃)，计灭菌时间，杀菌过程中不断排除蒸汽管路及罐内的蒸汽冷凝水。结束灭菌操作时，先关闭所有排污阀及排气阀，然后关蒸汽进口阀，打开无菌空气进口阀，以确保罐内压强。第五十九页，共九十七页，2022年，8月28日设备及管路的杀菌空气分布器的蒸汽灭菌管路布置导流筒空气分布器BA无菌空气蒸汽第六十页，共九十七页，2022年，8月28日设备及管路的杀菌浸没管路与旁路进口管的杀菌布管蒸汽蒸汽AB蒸汽进料管ABC第六十一页，共九十七页，2022年，8月28日蒸汽灭菌无菌排料ABCEDF蒸汽冷凝水排污或CIP返回排料系统蒸汽杀菌第六十二页，共九十七页，2022年，8月28日设备及管路的杀菌罐的CIP清洗系统蒸汽杀菌配管CIPABC蒸汽第六十三页，共九十七页，2022年，8月28日设备及管路的杀菌发酵罐搅拌器密封装置的蒸汽灭菌配管第六十四页，共九十七页，2022年，8月28日设备及管路的杀菌空气过滤器的杀菌止逆阀第六十五页，共九十七页，2022年，8月28日设备及管路的杀菌阀门的杀菌(2)隔膜阀第六十六页，共九十七页，2022年，8月28日设备及管路的杀菌取样阀门的杀菌第六十七页，共九十七页，2022年，8月28日保证管道彻底灭菌的设计要求管道应有一定的斜度，通常取1/100或更大；凹陷低点安装排污阀；管路有足够的支撑点；尽可能减少和简化管路，尽可能少用弯头管件和阀门；尽可能减少最高与最低点，且在每个最高点装设蒸汽进管，在最低点均装冷水阀；每个罐及管道尽可能分开灭菌。这样才能保证蒸汽杀菌的严密性与稳定安全性。设备及管路的杀菌第六十八页，共九十七页，2022年，8月28日1罐2罐两个罐及连接管的蒸汽杀菌ACBDEF第六十九页，共九十七页，2022年，8月28日冷凝水的排放自由排放用汽水阀自动排放利用计算机自动控制排除冷凝水设备及管路的杀菌第七十页，共九十七页，2022年，8月28日空罐灭菌

灭菌温度和灭菌时间的要求是高温长时(121℃，60分钟)，既合理经济，又能杀灭设备中各死角残存的杂菌或芽孢。

设备及管路的杀菌第七十一页，共九十七页，2022年，8月28日通气发酵罐清洗与灭菌管路图止回阀第七十二页，共九十七页，2022年，8月28日三路进汽：在对培养基灭菌时，直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间,达到培养基灭菌之目的。实罐灭菌的进汽和排气原则:“非进即出”，就是说所有进入发酵罐的管道在灭菌过程中如果不进入蒸汽就一定要进行排气，使所有管道都被蒸汽（或二次蒸汽）通过，得以灭菌。不能有既不进汽也不排汽的管道（死角）存在。

发酵罐实罐灭菌第七十三页，共九十七页，2022年，8月28日四、操作失误导致染菌及其防治1、通常对于淀粉质培养基的灭菌采用实罐灭菌较好，先配料，过滤大颗粒物之后，在进行灭菌。2、在灭菌升温时，要打开排气阀门，使蒸汽能通过并驱除罐内冷空气，一般可避免“假压”造成染菌（自动控温）。3、为加快升温速度，凡能进蒸汽的管路在灭菌时都可同时进汽，但各管路的阻力不同，易造成蒸汽短路现象，使物料受热不匀，需调整各进汽管的流量。4、灭菌蒸汽要求采用饱和蒸汽，冷凝水越少越好，灭菌时蒸汽压力要求平稳。第七十四页，共九十七页，2022年，8月28日5、泡沫问题培养基和水的传热系数比空气的传热系数大，如果灭菌时升温太快，培养基急剧膨胀，发酵罐内的空气排出较慢，就会产生大量泡沫，泡沫上升到发酵罐顶，泡沫中的耐热菌就不能与蒸汽直接接触，未被杀死。4、其他操作问题

实罐灭菌时，罐内因蒸汽冷凝而使罐压突然降低甚至会形成真空，所以此时必须将无菌空气通入罐内保持一定压力，并注意压力变化，随时进行调节。5、发酵过程越来越多的采用自动控制，一些控制仪器逐渐被应用。一般常采用化学试剂浸泡等方法来灭菌。第七十五页，共九十七页，2022年，8月28日五、发酵染菌后的措施1、如果种子培养或种子罐中发现污染——倒罐2、发酵早期染菌——可以适当添加营养物质，重新灭菌后再接种发酵。或采用加大接种量的办法3、中、后期染菌，如果杂菌的生长将影响发酵的正常进行或影响产物的提取时，应该提早放罐。但对发酵液中的碳、氮源还较多，此时应先设法使碳、氮源消耗，再放罐提取。或在染菌的发酵液内添加抑菌剂(如小剂量的抗菌素或醛类)用以抑制杂菌的生长也是一种办法。第七十六页，共九十七页，2022年，8月28日5、染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌。6、染菌厉害时，车间环境（罐内、原料储罐等）要用石灰或甲醛熏蒸消毒。7、凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药。第七十七页，共九十七页，2022年，8月28日六、染噬菌体的防治1、染噬菌体对发酵的影响发酵过程中如果受噬菌体的侵染，