分子生物学技术的原理及其应用

分子生物学技术的原理及其应用

分子生物学教研室

一.分子杂交与印迹技术Section1NucleicAcidBlottingandMolecularHybridization二.聚合酶链式反应（PCR）的原理与应用Section2PolymeraseChainReaction三.DNA序列测定Section3DNASequencingOutline2023/2/152第一节.分子杂交与印迹技术2023/2/153（一）分子杂交（二）印迹技术（三）探针技术分子杂交与印迹技术的原理2023/2/154复习提问：什么是分子杂交？DNARNA具有互补序列的两条核酸单链，在一定条件下，按碱基互补配对的原则形成双链的过程。RNADNA（一）.分子杂交2023/2/155复习提问：什么是DNA的变性与复性DNA变性：

变性条件：加热、强碱和有机溶剂氢键断裂，两条单链分开磷酸二酯键不受影响，碱基排列顺序不变HighpHLowsaltHightemperatureDNA变性是指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链。*2023/2/156DNA复性：当去掉外界的变性因素，被解开的两条单链又可重新互补结合，恢复成原来完整的DNA双螺旋结构分子。lowpHhighsaltlowtemperatureDNA的复性：互补单链通过碱基配对形成氢键2023/2/157什么是核酸分子杂交？（what

is

Nucleic

acid

molecular

hybridiaztion?）以DNA的变性与复性为理论基础指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程。*2023/2/158（二）.印迹技术印迹技术(blotting)：将各种生物大分子从凝胶转移到一定固定基质上的过程.生物大分子:DNARNA蛋白质1975年，英国人Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。EdwinMellorSouthern埃德温·迈勒·萨瑟恩2023/2/159

dry毛细管虹吸法Southern转膜示意图（1）毛细管虹吸法2023/2/1510

需要12-16h2023/2/1511

（2）电转移印迹技术电转法转膜装置示意图需要2-3h2023/2/1512探针的概念被标记上可检测信号的、已知序列的单链核酸片段

(RNA或DNA)探针是如何被标记上的？什么是探针？（what

isprobe?）（三）.探针技术*2023/2/1513探针的标记物（1）同位素标记物：32P，35S，3H32P标记dNTPDIG标记dNTP（2）非同位素标记物：生物素、地高辛、荧光素2023/2/15143’5’3’3’5’5’5’DNAPolIdNTPs+labled-dATPDNaseI3’3’5’5’5’3’ds-DNAtemplateMg2+DNA边降解边合成DNA合成时参入标记的单核苷酸5’-3’聚合酶的活性5’-3’外切酶的活性缺口平移法探针的标记方法DNAPolI延着5‘-3’方向切旧链，然后再合成新链2023/2/1515随机引物法DNA合成时参入标记的单核苷酸2023/2/15162.加入变性的探针DNA1.变性3.杂交4.检测杂交体探针技术用一条已知的核酸序列，用这条核酸可以检测出有没有与其互补的碱基序列2023/2/1517利用核酸探针检测DNA的核酸杂交称作Southern印迹杂交利用核酸探针检测RNA的核酸杂交称作Northern印迹杂交Southern印迹杂交Northern印迹杂交斑点杂交原位分子杂交印迹杂交的类别及应用DNA芯片Western印迹杂交利用抗原抗体的特异性结合检测样品中的某种蛋白质的方法2023/2/1518Southern印迹杂交2023/2/15

1975年，英国人EdwinMellorSouthern创建①制备待测DNA样品、标记基因探针；②电泳分离待测DNA样品；③待测DNA样品的变性、转膜；④杂交；⑤显色。将电泳分离的待测基因组DNA酶切片段转移到一定的固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交的过程。基本流程如下：*19EcoRI第一步：提取基因组DNA,用内切酶消化的DNA片段并进行电泳分离（1）DNA

isolation（2)

RE

Digestion（3）Agarose

gel

electrophoresis2023/2/1520TGAATCACATTG第二步：将凝胶电泳的DNA经NaOH变性及中和后，转移到合适的固相支持物上如硝酸纤维素膜（1）DNA

is

denatured

by

NaoH（2）Neutralize

(中和）2023/2/1521（3）TransferDNAtoMembrane（转膜）2023/2/1522（1)Hybridization杂交

第三步：将标记的探针与膜上的DNA进行杂交2023/2/1523（2）Wash

(洗膜）2023/2/1524

第四步：利用放射自显影或显色的方法检测目的DNA的存在放射自显影的原理是利用放射性同位素所发射出来的带电离子(α或β粒子)作用于感光材料的卤化银晶体，从而产生潜影，成为可见的像。2023/2/1525Southern印迹杂交过程小结印迹杂交2023/2/1526Southern印迹的应用Southern印迹杂交在产前诊断、DNA图谱分析及癌基因检测等方面有重要价值。2023/2/1527DNA指纹图谱（DNAfingerprinting）

1．高度的特异性：

基因多态性，每一个人所特有的。2．稳定的遗传性性：DNA指纹图谱中几乎每一条带纹都来源于父母。3．体细胞稳定性：

任何细胞中的的DNA指纹图形完全一致。2023/2/1528Southernblot检测DNA指纹基因具有多态性，每个个体酶切后的片段的长度不同，电泳后有不同的带型。个体的核基因组的酶切片段：杂交短串联重复序列（微卫星DNA）：由2-6碱基对构成核心序列

呈串联重复排列

不同个体间存在有串联数目的差异探针选择：2023/2/1529结果用探针杂交后，每个人的杂交带都是不一样的。2023/2/1530

123样本4567应用：犯罪现场七个嫌疑人中那个是罪犯？2023/2/1531应用：亲子鉴定这两个孩子那个是父亲的亲生孩子？2023/2/1532

将电泳分离的待测RNA从琼脂糖凝胶中转移到固相支持物上，然后与核酸探针杂交，进而定性分析mRNA。基本程序：1、RNA的电泳2、转膜:将RNA转移到固相支持物上3、杂交:膜上的RNA的与探针的杂交4、检测杂交信号Northern印迹杂交可以检测特定基因的表达丰度、样式，2023/2/15332023/2/15与SouthernBlot极为相似Northern印迹特点检测RNA电泳前无需酶切3电泳后无需变性34Northern印迹杂交已被RT-PCR方法取代（下节课讲）Northern杂交的探针可以是DNA，也可以是RNA。Northern杂交可以相对定量检测细胞内的特定mRNA表达水平。2023/2/1535蛋白质印迹杂交在电场的作用下将电泳分离的蛋白质从凝胶转移至一种固相支持物，然后用这种蛋白质的特异抗体来检测。2023/2/1536基本程序：1、电泳分离蛋白质2、蛋白质的转膜3、蛋白与抗体结合4、检测抗体信号蛋白质印迹杂交2023/2/1537

SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。

第一步：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳2023/2/1538

第二步：转膜（电转移）将蛋白质转移到NC膜上或其他膜上。（只有电转移方可实现）2023/2/1539

第三步：抗原抗体反应蛋白质的分析主要靠抗体来进行。特异性抗体（称为一抗：首先与膜上相应的蛋白分子结合，然后于标记的第二抗体结合。2023/2/1540化学显色法:同位素法:化学发光法:荧光底物法：

第四步：显示反应2023/2/1541斑点杂交（DotBlot）将RNA或变性DNA样品点到一张硝酸纤维素膜上，并将膜按区域划分，点多个样品，烘烤固定，然后与特定探针进行杂交。优点：简单、快速、可同时检测多个样品2023/2/1542突变杂合子镰状红细胞贫血患者的基因诊断正常的（N）的ASO探针：

5´-ACTCCT

GAG

GAGAAGTCTGC-3´突变的（M）的ASO探针：

5´-ACTCCTGTG

GAGGAAGTCTGC-3´突变序列的探针正常序列的探针正常纯合子突变纯合子镰状红细胞贫血是由珠蛋白的β基因发生单一碱基突变引起，正常β基因的第6位密码子为GAG（编码谷氨酸），突变后为GTG（编码缬氨酸）2023/2/1543反向斑点杂交（reversedotblotting，RDB）2023/2/1544荧光原位分子杂交（FISH,FluorescenceInSituHybridization）

在保持细胞基本形态的情况下（不从组织或细胞中提取核酸），用探针在细胞的原位检测靶DNA的存在情况--Chromosome+DNAprobe--LocatespecificgeneonChromosome2023/2/1545分子杂交的基本原理、“探针”。1.SouthernBlotting

（原理，过程，用途）2.NorthernBlotting

（过程，用途）4.insituhybridization（FISH）**3.DotBlotting（特点）小结3.WesternBlotting

（过程，用途）*2023/2/1546DNA芯片技术(Genechip)是指在固相支持物上直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息。样品被标记荧光探针被固定到固相支持物上。高通量，自动化*2023/2/1547正常组织异常组织对照组mRNA实照组mRNACy5标记mRNACy3标记mRNA等量混合激光扫描信息分析