仪器教学：从基因组到蛋白质组09410课件

仪器分析教学从基因组到蛋白质组

2009.4.10.内容提要一.人类基因组研究的意义二.人类基因组研究的现状三.蛋白质组研究的意义和前景四.蛋白质组研究的技术路线一.人类基因组研究的意义1986年美藉意大利科学家提出进行全基因分析，以寻找与正常人基因不同的肿瘤基因。1990年美国能源部和国立卫生研究院集中一批优秀的科学家准备投资30亿美元进行为期15年的人类基因组研究计划，对人类基因组作图和序列分析。希望在分子水平上破译人类所有的遗传信息，即测定大约30亿碱基对DNA序列和识别其中所有的基因（约10万,5万，4万，3万）。二.人类基因组研究现状我国在人类基因组研究方面取得了显著进展:1、湖南医科大学夏家辉等:家族性耳聋基因分析.NatureGenetics1998.20(4):370-3932、上海第二医科大学陈竺等：白血病相关基因分析3、上海肿瘤所顾健人等:肝癌相关基因分析4、中科院昆明生物所褚家佑等:中华民族基因关系分析PNAS1998;95:11763研究现状5、复旦大学遗传所人类基因研究方面:发现新基因2500确定功能的新基因250条申请专利200项疾病相关基因分析Genomics6、中科院遗传所人类基因研究中心:注册承担30Mb，占全部基因的1％，2000.3.完成。7、国家科技部人类基因研究南方中心，北方中心:希望完成1000条基因,占全部的1％.8、其它。微生物基因组学研究1、痢疾杆菌全基因组测序北京病毒所金奇教授课题组2、表皮葡萄球菌全基因组测序上海医科大学闻玉梅院士课题组人类个体化全基因组学研究1、西方白种人2、东方黄种人3、非洲黑种人三.蛋白质组研究的意义和前景（一）蛋白质组学的概念（二）基因组和蛋白质组的比较（三）意义和前景WhatisaProteome?TheentirePROTEinpopulationexpressedbythegenOMEofaparticularcellortissuetype.Whyareproteinsimportant?Thegenomesequencemaybetheblueprintofacell,butproteinsarethemajorbuildingblocks.（二）基因组分析和蛋白质组分析的比较

基因组蛋白质组

组成4种碱基20种氨基酸；翻译后加工组分不变动态变化：不同细胞；不同时空.分布定位于染色体分布于整个细胞测序方法简单，已完善复杂：N末端已完善C末端，发展中2、蛋白质组研究的数据与基因组数据的整合，将会在后基因组（post-genome)研究－基因组功能研究上发挥重要作用。因此，蛋白质组研究可取得十分丰富的数据资料，能进一步带动生物信息学等现代边缘学科的发展；同时，也推动医药产业的发展。3、我国目前提出人类重要疾病相关的蛋白质组学研究，集中在蛋白质组动态变化的功能蛋白质组研究上，越过总蛋白质组中“全部”这一难点，更具实践意义。在研究许多功能蛋白质组的基础上综合起来，就能描绘出接近于“全体蛋白质”的蛋白质组。

四.蛋白质组研究的技术路线（一）不同结构层次的分离（二）蛋白质组学研究的基础（三）质谱分析相关的技术（一）不同结构层次的分离以阐明基因组功能为目的，蛋白质组研究必须获得这样的信息：细胞、组织或有机体内的蛋白质种类，翻译后修饰，分布，表达时间和表达量等。为此，蛋白质组分析首先要求分离亚细胞结构、细胞或组织等不同生命结构层次的蛋白质。1、超速离心机分离方法贝克曼超速冷冻离心机

主要性能：最高转速80000RPM;最大离心力51500g；可调温度范围-3040摄氏度；备有不同定角转头，分别适用于10ml，50ml，250ml体积样品的分离和提取。

主要功能及应用范围：广泛应用于生命科学等研究领域的样品提取和分离；用于生物体细胞中的核酸，蛋白，酶等的提取和分离；也可用于对所研究的对象如生物细胞，细菌，血清，蛋白等有机物或无机物的乳浊液，悬浮液，胶体样品进行分离，提取，浓缩等制备工作。

蛋白质分析鉴定的基本要求（一〕检查指标分析方法鉴定标准

分子量SDS－PAGE电泳银染色一条带符合设计要求指标等电点等电聚焦电泳电泳银染色一条带，扫描95％以上浓度紫外分光光度法浓度(mg/ml)＝1.45OD280-0.74OD260纯度HPLC（或FPLC）层析一个峰（95％）WesternBlot有一条活性蛋白带

蛋白质分析鉴定的基本要求（二）检查指标分析方法鉴定指标

生物学活性细胞学实验符合国际规定的比活性和动物实验特定生物学检测指标结构分析氨基酸组成分析各种氨基酸组分比例符合预计标准氨基酸序列分析N－末端15个氨基酸符合要求肽谱图符合定点降解（二）蛋白质组研究的基础：

1.双向电泳技术2.蛋白质的氨基酸组成分析3.蛋白质的氨基酸序列分析4.肽谱分析5.微量测序（二）蛋白质组研究的基础

1.双向电泳技术2.蛋白质的氨基酸组成分析3.蛋白质的氨基酸序列分析4.肽谱分析5.微量测序蛋白质组学研究的基本过程样品2-DPAGE成像分析蛋白质胶上酶解或膜转移等方法提取蛋白质或多肽混合物质谱测定肽质量及部分序列Edman降解N-terminal序列Databasesearching鉴定蛋白质1、双向凝胶电泳（2－D）双向凝胶电泳的基本原理是蛋白质首先根据其等电点在pH梯度胶中等电聚焦，然后按照它们的分子量大小进行SDS－PAGE第二次电泳分离。蛋白质组研究通常需要对双向电泳分离的蛋白质进行鉴定。一种细胞或组织的蛋白质组双向电泳后可分离到几千甚至上万种蛋白质，一般对它们采取分级鉴定，即先用快速、低廉的方法，再采用耗时、耗资的方法去鉴定蛋白质。2、蛋白质的氨基酸组成分析

氨基酸组成分析由于耗资低而常用于蛋白质鉴定。组成分析对杂质污染较敏感。通过组分分析，可得到某一种蛋白质中所含各种氨基酸的比例。3、蛋白质的氨基酸序列分析

Edman降解法测定的蛋白质和多肽的氨基酸序列非常准确，但每次只能测定从N端起1－15个氨基酸。一个大的蛋白质分子往往含有多于100个以上的氨基酸。因此需要进一步进行肽谱分析。4、肽谱分析

对于大于100个氨基酸的蛋白质需要化学方法（如CNBr）或生物学方法（酶解）将肽链断裂成不同短肽，测序后进行拼接而构成完整的序列。5、微量测序

在Edman降解的基础上，目前已实现蛋白质微量测序的自动化。首先使凝胶分离的蛋白质直接转印到PVDF膜或玻璃纤维膜上，考马斯亮兰染色，甲醇－冰乙酸脱色，直接将印迹有蛋白质的PVDF斑点块或条带，剪切下来，置于蛋白质测序仪中，可用于极微量水平蛋白质的鉴定。

蛋白质活性位点的分析

蛋白样品SDS－PAGE转移到NC，PVDFWesternBlot阳性条带考马斯亮蓝R250染色对应条带甲醇脱色测序PSAPGLPVGT抗原抗体免疫反应的高度特异性PVDF膜作载体测序的高度敏感性

对于蛋白质活性位点的分析和基因工程表达产物的快速鉴定，蛋白质组学中极微量蛋白分析提供一个特别有用的新手段。相结合（三）与质谱分析相关的技术

质谱分析已成为连接蛋白质与基因的重要技术，开启了大规模自动化的蛋白质鉴定大门。目前质谱广泛应用在蛋白质的纯度鉴定、分子量测定、序列测定、肽谱分析、二硫键、乙酰化、糖基化、磷酰化，以及非共价键结合等研究中。质谱仪是利用电磁学原理，使气体分子产生带正电荷的离子，并按离子的质荷比将它们分离，同时记录和显示这些离子的相对强度的一种仪器。质谱法(MassSpectroscopy,MS)一般采用高速电子束撞击气态分子，将分解出的阳离子加速导入质量分析器中，然后按质荷比(m/e)的大小顺序进行收集和记录下来，即得到质谱图。根据质谱图峰的位置，可以进行定性和结构分析；根据峰的强度，可以进行定量分析。一、异烟肼耐药菌株和敏感菌株的比较蛋白质组学研究方法结核分支杆菌培养7H9Broth细菌壁蛋白的制备双向电泳考马斯亮蓝染色或银染MALDI-TOF-MS数据库检索耐异烟肼菌株细胞壁蛋白质组双向电泳图谱结核杆菌H37Rv株细胞壁蛋白质组双向电泳图谱异烟肼耐药菌株和敏感菌株的差异蛋白分析质谱分析鉴定的6个差异蛋白

蛋白质名称分子量/等电点可比度（％）1、海藻糖磷酸磷酸酶45888/5.343%2、铁钼蛋白A41721/8.725%3、莽草酸脱氫酶28746/6.243%4、葡萄糖胺果糖-6-磷酸氨基转移酶67503/5.430%5、吲哚-3-甘油磷酸合成酶28146/5.234%6、TetR家族转录调节因子24999/5.637%

1.莽草酸脱氫酶Rv2552c,aroE2.铁钼蛋白Rv3109，moaA3.海藻糖磷酸磷酸酶Rv2006，otsB4.葡萄糖胺果糖-6-磷酸氨基转移酶Rv3436c,gimS5.吲哚－3－甘油磷酸合成酶Rv1611，trpC6.TetR家族转录调节因子Rv25066个差异表达蛋白及基因编号

蛋白质名称分子量/等电点可比度(％)基因信息1.海藻糖磷酸磷酸酶45888/5.343%Rv2006，otsB2.铁钼蛋白A41721/8.725%Rv3109，moaA3.莽草酸脱氫酶28746/6.243%Rv2552c,aroE4.葡萄糖胺果糖-6-磷酸氨基转移酶67503/5.430%Rv3436c,gimS5.吲哚-3-甘油磷酸合成酶28146/5.234%Rv1611，trpC6.TetR家族转录调节因子24999/5.637%Rv2506样品制备（菌体蛋白）双向电泳数据库搜索蛋白质鉴定PMF样品制备

MALDI-TOF-MS质谱检测三、利福平耐药菌株和敏感菌株的比较蛋白质组学凝胶图象分析利福平耐药菌株菌体蛋白比较蛋白质组分析pH:47—66.2KDa—43.0KDa—31.0KDa—