医学交流课件：植物细胞制药

植物细胞制药概述植物细胞中药用成分植物细胞制药技术及工艺植物药物次生代谢产物转基因植株或植物细胞

第一节概述一、发展史十九世纪上半叶，SchleidenandSchwann提出了细胞学说。单细胞观点离体培养1934年White建立了第一个无性繁殖系，之后重点是植物细胞的培养及营养素60年代分离出植物的原生质体70年代，优化细胞生长和研究次级代谢产物80年代后植物细胞基因工程基本概念植物细胞制药植物细胞制药是指在无菌和人工控制的营养及环境条件下利用植物细胞培养技术来控制培养植物细胞、组织、器官以获得某些有用的次级代谢产物的技术植物细胞的分化和脱分化细胞分化（differentiation）:细胞在生长发育过程中其形态、结构生理功能等方面发生某些差异变化的复杂过程，在这个过程中会呈现极性现象、细胞不均等分裂位置效应等各种现象。脱分化（dedifferentiation）：脱分化又称去分化。是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程。

一个已分化的细胞若要表现其全能性，形成完整植株，首先要经历脱分化过程形成分生细胞或分生细胞团，然后再经历再分化过程形成胚胎或器官发育为完整的植株。愈伤组织（calluscell）是在一定条件下，在植物的伤口或外植体的切口部位长出的蓬松的细胞团，它既是一种组织，又是一种脱分化的细胞，具有再分化能力；既可以用于次级代谢物的生产和生物转化，又可以再生成为植株。毛状根（hairyroot）是植株或其组织、器官、细胞受到发根农杆菌感染后发生病理变化而形成的类似头发一样众多而细长的根组织。生长快速，易于培养，遗传上稳定且易于操作，能改变植物的次生代谢。初生代谢产物和次生代谢产物初生代谢产物包括糖和淀粉、脂肪和脂肪酸、氨基酸和蛋白质、核苷和核苷酸等。它们不仅满足了植物本身的生活活动需要，而且可以作为工业生产的原料。次生代谢产物包括酚类、黄酮类、香豆素、木质素、生物碱、有机酸、糖苷、皂苷等等。它不是生命体的主要组成，但在保持植物生命的抗逆性、抗病并和抗虫性以及担当信号分子方面起着重要作用。植物细胞制药的优势及发展优势：不受气候、土壤等外界条件影响培养物无污染产物的产率高生产周期快节约天然资源应用展望用细胞培养方法生产药用次级代谢产物探索药用成分的生物合成路线利用植物培养细胞进行生物转化转基因植物第二节植物细胞中的药用成分1细胞后含物：储藏物质或废弃物质，分布于液泡内。如生物碱、糖苷类、挥发油、有机酸2生物活性物质：对细胞内生化代谢和生理活动起着调节作用。酶类、维生素、植物激素、抗生素和植物激素第三节植物细胞制药技术植物细胞培养特点：

对数期，细胞重量增加；稳定期，次生代谢产物积累的最多；植物细胞很少以单一细胞生长，往往以非均相集合体的细胞团形式悬浮生长；植物细胞多为好气性，细胞壁骨架脆弱，在搅拌时注意避免造成细胞破碎和损伤。

植物材料的准备—灭菌培养基组成—无机盐、碳源、植物生长调节剂、氮源、维生素培养方法

单细胞培养法单倍体细胞培养愈伤组织培养毛状根诱导和培养植物细胞培养反应器转基因植物一、转基因植物转基因植物技术(planttransgenetictechnology)是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。植物受体目的基因转化方法选择和鉴定1、植物受体外植体（explant）：植物的外植体是指用于遗传操作的植物的某一器官或部分，通过离体组织培养可以再生成完整的新植株，在转基因实验中用于作为外源基因转入的受体。因为各种植物本身的特点，用于作为外植体的植物部分有很大差异。自转基因工作以来，人们采用过：幼花穗，幼叶、子叶节，叶盘，幼芽生长点，成熟种子胚，未成熟种子幼胚，花粉及小胞子及来源于植物幼嫩组织的原生质体等大部分植物的器官。几种受体系统原生质体受体系统：指去除细胞壁后的“裸露”细胞，具有全能性。愈伤组织受体系统：外植体经组织培养所产生的愈伤组织种质系统：以植物的生殖细胞如花粉粒、卵细胞为受体细胞进行基因转化。胚状体再生系统：最理想的受体系统，体细胞胚是具有卵细胞特性的胚性细胞发育而来。直接分化芽受体系统：由未分化的细胞直接分化形成。2、外源基因的制备转基因的基因来源可以是植物，也可以是动物或微生物。为了获得高水平的表达效果，要将目的基因进行重组改造，以适应植物转基因工作的需要。通常是将分离出的目的基因整合到某个载体上，转化大肠杆菌或农杆菌。高效表达载体的构建，启动子、增强序列的选择、载体和菌种的不同，都对转基因的最后结果产生重要影响3、筛选植物转基因实验过程中，都要对经过遗传转化的群体进行筛选，使转入外源基因的组织或细胞在选择压力下正常生长发育，而抑制未转化部分的生长，直到死亡。选择的基本原理是使未转化的组织或细胞，在含有选择剂的培养基上新陈代谢受阻而停止生长，最后死亡。选择剂通常为抗生素或杀草剂。选择过程一般为3-4个周期，每个周期为3-4周。转基因植物的筛选和鉴定方法检测基因功能来划分调控基因检测法选择标记基因检测法报告基因检测法目的基因检测法检测基因功能来划分检测的不同阶段区分整合水平表达水平转录水平翻译水平4、鉴定1）分子生物学鉴定：提供转基因后的植物组织或再生植株外源基因存在与否、基因拷贝数及表达水平等PCRSouthernhybridyzationNorthernhybridyzationELISAWesternimmunoblot

2）生物学功能鉴定：是对导入的外源基因应当表达的生物学功能的检测。转化植株生物学功能的测定以转入外源基因预期的功能来设计检测方法，对获得的转基因植株进行评价3）遗传学鉴定遗传稳定性转化植株后代的分离比例二．外源基因导入植物的主要方法（一）转化体系需要满足的条件受体组织可以离体再生或扩繁；有效的转入基因的方法；筛选转化组织的选择系统；获得可育转化植株频率；简单、有效、可重复、不依赖基因型以及成本低；离体组织培养的时间短，以减少体细胞变异和不育株比例（二）常用的转化方法：载体介导的转化方法，基因直接导入法种质系统法1载体介导的转化方法即将目的基因插入到农杆菌的质粒或病毒的DNA等载体分子上，随着载体DNA的转移而将目的基因导入到植物基因组中。农杆菌介导和病毒介导法就属于这种方法。根瘤毛状根农杆菌介导法早在上世纪初Smith等人就发现作为自然存在的遗传工程，土壤中生存的根癌农杆菌可以将外源基因转入植物而导致根肿瘤的生成。农杆菌的致病基因在酸性条件和酚类诱导物（如乙酰丁香酮）的存在下，微生物DNA分子的一部分可以转入植物细胞并插入到植物基因组中。1977年Chilton等人证明根癌农杆菌的Ti质粒的一部分转入植物细胞，整合进植物基因组使植物产生肿瘤。农杆菌转入植物的DNA片段称为转移DNA（T-DNA）。基因转移技术的一般操作中间载体的表达构建（T-DNA克隆至大肠杆菌载体）植物表达载体的构建（中间载体加启动子）表达载体转化农杆菌，与Ti质粒发生同源重组农杆菌转染受体植物

以根瘤农杆菌转化双子叶植物叶片为例1.将表面消毒的叶片切成小块2.小块在过夜培养并稀释到一定浓度的根癌农杆菌液中浸泡几分钟，以便让根癌农杆菌感染叶片切块的伤口。3.从菌液中捞出小块，培养基中培养2天。4.在含头孢霉素选择培养基中筛选转化细胞。继续培养，转化的细胞分化出芽。5.将芽转入含有抗生素的生根培养基上，诱导生根。6.将完整的转基因植株移栽到土壤中。特点：转入的基因经常是单拷贝表达水平高可以转入大的DNA片段（可达150kb）不需贵重仪器没有必要对植物组织制造伤口超声波予处理植物组织，可以提高转化效率单子叶植物需要加入外源酚类物质，才能激活Vir区的基因，达到转基因的目的2基因直接导入法通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物的基因组中。物理方法包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法等；化学方法有PEG介导转化方法和脂质体法等。生物弹或粒子枪（BiolisticsorParticlegun）基因转化技术基本原理：将外源基因附在重金属如钨或金颗粒上，然后在一个真空的小室中采用高压将带有基因的金属颗粒轰击进入植物组织或细胞，少数基因将整和到基因组中，获得表达并可能传递给后代。在真空的小室中，依靠火药爆发、氦气、二氧化碳或放电，使金属颗粒获得高速目前以美国伯乐公司（Bio-Rad）的PDH1000型基因枪应用最为广泛

优点：操作容易；一次轰击可以转化大量细胞；几乎任何植物组织或细胞都可以使用基因枪进行转化；转入组织的深度可以用轰击压力和空间距离来控制缺点：转入的基因拷贝数是随机的；此外还容易将较大片段的基因断裂成小片段。基因枪转化成本高；嵌合体比率大；遗传稳定性差还可能发生共抑制现象(co-suppression)原生质体转化途径1982年Krens等人首次用PEG处理烟草原生质体获得了转化植株，开拓了用PEG进行植物转化的新途径采用机械或酶处理技术可以从未成熟胚、幼穗、叶肉、叶盘和花药等植物组织分离原生质体，然后用于遗传转化实验此法转入外源基因比较容易，但原生质体的分离和培养是相当困难的，所以，此方法的应用只限于少数实验室3种质系统法

以植物自身的种质细胞为媒介，特别是植物的生殖系统的细胞(花粉、卵细胞、子房和幼胚等)以及细胞的结构，将外源DNA导入完整植物细胞，实现遗传转化的技术称为种质转化系统(germlinetransformation)，该技术也称为生物媒体转化系统或整株活体转化(inplantatransformation)。这包括花粉管通道法、生殖细胞浸染法、胚囊和子房注射法等。花粉管通道法主要原理是：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。

早在70年代末，上海生物化学所的周光宇等科学家将从植物提取的总DNA在开花前后加到受体植物的柱头上，在受精的同时，外源DNA经过花粉管与花粉一起进入合子。在新的合子中携带有外源DNA。20余年来，我国科学工作者通过花粉管通道技术创造了一大批新型育种材料，有些并获得了新的商业品种花粉管通道法是一个不依赖于组织培养的将外源基因转入受体的简便技术，易于为广大育种人员进行操作缺少分子水平上的机理研究报告及证据，目前争议较大基本程序包括：外源DNA(基因)的制备；根据受体植物的受精过程及时间，确定导入外源DNA(基因)的时间及方法；将外源DNA(基因)导入受体植物；转基因植株目标性状鉴定及分子检测。

转化率：一般在10-2～10-1之间优点：不依赖组织培养人工再生植株，技术简单。不需要装备精良的实验室，易于掌握。受体材料为植株整体，操作简便。导入的DNA分子整合效率较高。特别适合于难以建立有效再生系统的植物。5、拟南芥菜（Arabidopsis）的转化方法在拟南芥菜的开花盛期，将花序倒浸于含有目的基因的农杆菌液中，真空条件下处理数秒钟，然后将处理过的植株移到正常生长条件下，让植株结实。其中有一部分种子被转化。将收获的种子用适当的筛选剂如抗生素、杀草剂等进行筛选，即可获得阳性转化植株尽管转化效率不高，但操作容易，重复性好，已经在很多实验室广为采用最近几年，更将拟南芥菜的转化方法发展为用农杆菌液直接喷在开花期的花序上，同样可以获得转化植株三、基因转植物的筛选和鉴定方法1、选择标记基因检测法标记基因（markergene)：是指其编码产物能够使转化的细胞、组织具有对抗生素或除草剂的抗性，或者使转化细胞、组织具有代谢的优越性。特征：编码一种不存在于正常植物细胞中的产物例如酶和蛋白质等；

基因较小，易构成嵌合基因；

能在转化体中得到充分表达；

容易检测，并能定量分析。常用的选择标记基因主要有两大类编码抗生素的抗性基因：如新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ，潮霉素磷酸转移酶基因hpt，二氢叶酸还原酶基因dhfr

编码除草剂抗性基因：如草丁膦乙酰转移酶基因bar、5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶基因epsps。2报告基因检测法

报告基因(reportergene)是用来检测转基因效率的酶的基因,它的产物的酶活性必须容易快速地测定。是常用来判断外源基因是否已经成功地导入受体细胞、组织或器官，并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。

理想的植物报告基因应具备以下的特征:编码的产物是唯一的,并且对受体细胞无毒。表达产物及产物的类似功能在未转化的细胞内不存在，即无背景。产物表达水平稳定，便于检测等。转基因植物常用的报告基因主要有：β-葡萄糖醛酸乙酰转移酶(β-glucuronidase,gus)基因(gus)

酶与底物发生作用，分光光度法胭脂碱合成酶(nopalinesynthase,nos)基因(nos)章鱼碱合成酶(octopinesynthase,ocs)基因(ocs)

纸电泳分离被检植物组织抽提物，电泳迁移率及染色比较荧光素酶(luciferase,luc)基因(luc)绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因(gfp)等。

氯霉素乙酰转移酶（Chloramphenicolacetyltransferase,CAT）基因这是植物转基因研究早期使用的标记基因，因为CAT活性的检测费时，又需要放射性试剂，现在很少使用。葡糖醛酸酶（β-glucuronidase，GUS）基因来源于大肠杆菌，是转基因研究以来应用最为广泛的一个标记基因。葡糖醛酸酶催化一些荧光和组织化学反应底物（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸酯）的水解反应，生成非常容易观察的兰色产物荧光素酶（Luciferase，Luc）基因

来源于火蝇的荧光素酶基因在ATP存在下催化D-荧光素的氧化反应生成氧化荧光素和黄-绿色光。这是一种对植物组织没有伤害的检测方法。缺点是观察所需的设备昂贵，荧光素酶检测底物对有些植物组织的渗透能力不强，影响实验结果。花青素（Anthocyanins，Ant）基因是来自于玉米、大麦和其它植物的与花青素合成有关的植物基因如C1,B,RandAnt.转入这些基因后，可以在植物组织上生成红色的花青素斑点。此基因不需任何底物就可以检测，但使用局限性大，仅限于少数植物。绿色荧光蛋白（Greenfluorescentprotein，GFP）基因绿色荧光蛋白是海洋生物水母体内的一种发光蛋白，经过改造后用于做植物的标记基因，基因产物在兰色光或紫色光下可见绿色荧光，是最新发展起来的标记基因。因为它几乎克服了上述几种标记基因的所有局限性，因而尽管出现时间很短，已为普遍应用到转基因工作的各个方面。筛选和鉴定工作步骤筛选转化细胞

对转化植株进行分子生物学鉴定

进行性状鉴定及外源基因的表达调控研究

遗传学分析

四、作为生物反应器的转基因植物抗性基因工程植物品质改良基因工程有特殊疗效的保健食品、功能性食品以及治疗性食品。转基因植物作为生物反应器可以生产细胞素、激素、单克隆抗体、营养蛋白、酶、疫苗、各种生长因子及其它一些药物与采用微生物发酵及动物细胞生产上述产品，转基因植物具有以下优点：植物细胞易于培养，操作简便，设备简单；生产成本低、易于后期提纯加工；安全性好，不容易被病毒或其它病原菌污染；转基因植物及其种子易于储存、运输；可以大规模生产。转基因植物生产疫苗已经用转基因植物生产乙肝疫苗、肠毒素B亚单位疫苗、链球菌表面蛋白疫苗和一些兽用疫苗等一大批产品用转基因植物生产出的疫苗根据需要有的要经过提纯加工后使用，也可以直接用来做食品疫苗或家畜食用的饲料疫苗