第七章食品检验的课件

第七章食品卫生微生物学检验第一节细菌的生理生化反应

各种细菌具有不同的酶类，因此分解糖类、蛋白质及各种氨基酸的能力不同，所生成的代谢产物也不一样。应用鉴别培养基,观察其生化反应情况,是鉴别细菌的重要手段之一。现将常用的生化反应试验进行介绍。(一)糖类代谢试验1．糖(醇)类发酵试验各种细菌含有发酵不同糖(醇)类的酶，所以分解糖(醇)的能力各不相同。有的能分解某些糖(醇)类，有的则不能分解。有的分解某些糖(醇)类产酸、产气，有的则仅产酸，而不产生气体。根据这些特点,可鉴别细菌。2．V—P试验(伏—普二氏试验)某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，再将丙酮酸脱羧，变为乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境下，被空气中的氧气氧化为二乙酰，二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色的化合物。故在培养基中加入少量含胍基的化合物，如肌酸或肌酐等，可以加速这个反应。3．甲基红(MR)试验许多细菌如大肠杆菌等，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降至4.5以下，这时加入甲基红指示剂呈红色。(甲基红指示剂变色范围为pH4.4(红色)一pH6.2(黄色))。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质(如醇、酮、醛、气体和水等)，则培养的酸度仍在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色是为阴性。4．

β—半乳糖苷酶试验(ONPG)具有半乳糖苷酶的细菌，能水解邻硝基酚—β—D半乳糖苷，而释放出黄色的邻硝基酚，用以鉴别肠杆菌，如迟缓发酵乳糖的肠杆菌，为阳性反应。

5．七叶苷分解试验能分解七叶苷的细菌，其代谢产物与铁离子结合后，产生黑色沉淀，使培养基变黑。6．石蕊牛乳试验牛乳中含大量的乳糖和酪蛋白，营养丰富，一般细菌均能在其中生长。但各种细菌对这些物质的分解能力不一样。故可观察下列不同的反应。(1)产酸若发酵乳糖产酸，使石蕊指示剂变为粉红色。(2)产气若发酵乳糖同时产气者，可冲开覆盖在培养基上的凡士林。(3)凝固若发酵乳糖产酸甚多，可使酪蛋白凝固。(4)胨化若将凝固的酪蛋白继续水解成蛋白胨，此时牛乳培养基的上段变清。

(5)产碱若不发酵乳糖，分解含氮物质，生成氨及胺，使培养基变碱性，石蕊指示剂为蓝紫色。7．葡萄糖氧化—发酵试验细菌对糖的代谢，分为有氧氧化和无氧氧化两种类型。在有氧环境下氧化完全，生成二氧化碳和水。在无氧环境下，进行不完全的分解(发酵)，生成酸类、醇类和气体。氧化型的细菌在无氧环境中，不能分解糖。发酵型的细菌不论在有氧或无氧的环境中，都可以分解糖。(二)有机酸盐及铵盐利用试验1．枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐培养基系一综合性培养基，其中枸橼酸钠为碳的唯一来源，磷酸二氢铵为氮的唯一来源。有的细菌如产气杆菌等，可利用枸橼酸盐作为碳源，能在此培养基上生长，并且分解枸橼酸盐而最后产生碳酸盐，使培养基变碱性。这样培养基中的溴麝香草酚兰指示剂由绿色变为深蓝色，是为枸橼酸盐可利用试验阳性。若细菌不能利用枸橼酸盐作为碳源，在此培养基上就不生长，培养基则不变色，是为枸橼酸盐利用试验阴性。

2．缩苹果酸盐利用试验缩苹果酸盐培养基，也是一种综合性培养基。缩苹果酸钠为碳的唯一来源，硫酸铵为氮的唯一来源。有的细菌如亚利桑那杆菌，能利用培养基中的缩苹果酸盐作为碳源而生长，并使培养基呈碱性反应。此时培养基中的溴麝香草酚兰指示剂则由绿色变为深蓝色，是为阳性。但有些细菌如大肠杆菌、沙门氏杆菌、志贺氏杆菌等，则不能利用缩苹果酸盐为碳源，故在此培养基上不生长。培养基颜色无变化，是为阴性。(三)蛋白质及氨基酸代谢试验1．靛基质(吲哚)试验某些细菌，如大肠杆菌、变形杆菌等，能分解培养基内蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质(吲哚)，再与试剂对二甲基氨基苯甲醛作用后，形成红色的化合物——玫瑰靛基质。2．硫化氢产生试验某些细菌如变形杆菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)，产生硫化氢，硫化氢遇到培养基中的重金属盐类如铅盐、铁盐等，则形成硫化铅或硫化铁黑色沉淀物。

3．尿素分解试验某些细菌如变形杆菌，具有尿素酶，能分解培养基中的尿素而产生氨，使培养基呈碱性，培养基中的酚红指示剂呈红色。4．明胶液化试验某些细菌具有胶原酶，分解明胶原，使明胶失去凝固能力，而呈液体状态，是为阳性。5．苯丙氨酸脱氨酶试验有的细菌如变形杆菌、普罗菲登杆菌，具有苯丙氨酸脱氨酶，可使苯丙氨酸琼脂培养基中的苯丙氨酸脱氨生成苯丙酮酸，苯丙酮酸与氯化铁作用，形成绿色化合物。(四)呼吸酶类试验1．氧化酶试验某些细菌如奈瑟菌和绿脓杆菌，具有氧化酶(靛基酚氧化酶)，能将盐酸二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺试剂氧化成红色的醌类化合物。2．细胞色素氧化酶试验某些细菌如绿脓杆菌，具有细胞色素氧化酶，在有分子氧存在的情况下，将试剂盐酸二甲基对苯二胺氧化，并和a—萘酚结合生成吲哚酚兰，而出现蓝色。此试验经常与氧化酶试验同时进行。

3．氰化钾抑制试验有的细菌被一定浓度的氰化钾所抑制而不生长，有的细菌则不被氰化钾抑制仍能生长，以此试验来鉴别细菌。4．触酶试验有些细菌如葡萄糖球菌等具有触酶，能催化过氧化氢放出初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。5．硝酸盐还原试验某些细菌如肠道杆菌，能还原培养基中的硝酸盐为亚硝酸盐，亚硝酸盐与试剂中的醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸再与对氨基苯磺酸和—萘胺结合生成显色（红色）的N——萘胺偶氮苯磺酸。(五)毒性酶类试验1．溶血试验某些细菌在代谢过程中，产生溶血素，使人或动物的红细胞发生溶解，可借以鉴别细菌。2．链激酶试验A组溶血性链球菌能产生链激酶，此酶能激活血液中的血浆素原使成血浆素，血浆素可溶解纤维蛋白，该试验用以测定链球菌的致病性，有一定意义。3．卵磷脂酶试验产气荚膜杆菌能产生卵磷脂酶(即毒素)，此酶可分解血清或卵黄中的磷脂，使血清或卵黄发生混浊现象。但这些现象，可被产气荚膜杆菌a抗毒素所阻止，故可用来鉴别产气荚膜杆菌。

4．卵黄沉淀试验此试验测定产气荚膜杆菌的卵磷脂酶(毒素)。因卵黄中含有可溶性磷脂蛋白复合物，经产气荚膜杆菌的卵磷脂酶作用后，分解为磷脂类及蛋白质类的沉淀物。5．磷酸酶试验金黄色葡萄球菌产生磷酸酶，因此在磷酸酚酞琼脂平板上生长发育后分解磷酸酚酞，遇到浓氨水使菌落变红色。6．DNA酶试验有些革兰氏阳性菌，如葡萄球菌、链球菌、芽孢杆菌等，产生细胞外脱氧核糖核酸酶，分解培养基中的脱氧核糖核酸，在菌落周围出现清晰、透明环，尤其是凝固酶阳性的葡萄球菌，此试验都呈阳性。

7．血浆凝固酶试验测定葡萄球菌的致病性，通常以能否产生血浆凝固酶为准，产生者为致病菌株，不产生者为非致病菌株。但也有少数致病菌株，不产生血浆凝固酶。葡萄球菌产生的血浆凝固酶有两种，一种是结合在细菌的细胞壁上，直接作用于血浆中的纤维蛋白，使细菌凝成块状，玻片法试验的阳性结果是由此酶形成。另一种是在菌体内产生释放到菌体外，称为游离血浆凝固酶，它能使血浆中的凝血酶原变为凝血酶类产物，呈现凝块为阳性，试管法的阳性结果是由游离的血浆凝固酶形成。第二节一般检验方法一、菌落总数测定菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或lmL检样中所含细菌菌落的总数。菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。每种细菌都有它一定的生理特性。培养时，应用不同的营养条件及其他生理条件(如温度、培养时间、pH、需氧性质等)去满足其要求，才能分别将各种细菌都培养出来。但在实际工作中，一般都只用一种常用的方法去作细菌菌落总数的测定，所得结果，只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧菌的菌落总数。1．设备和材料培养箱：(36±1)℃；冰箱：0～4℃；恒温水浴：(46±1)℃；天平；电炉：可调式；吸管：容量为lmL和10mL，标有0.1mL单位的刻度；广口瓶或三角烧瓶：容量为500mL；玻璃珠：直径为5mm;平皿:皿底直径为9-12cm;试管:18×200mm;酒精灯;均质器或乳钵；试管架；灭菌刀或剪刀；灭菌镊子；酒精棉球；登记薄；玻璃蜡笔。2．培养基和试剂营养琼脂培养基：75％乙醇。生理盐水或其它稀释液：定量分装于玻璃瓶和试管内，灭菌。3．检验程序菌落总数的检验程序如下：4．操作步骤(1)检样稀释及培养①以无菌操作，将检样25g(或25mL)剪碎放于含有225mL灭菌生理盐水或其它稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成1:10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000～10000r／min的速度处理lmin，作成1:10的均匀稀释液。②用lmL灭菌吸管吸取1:10稀释液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管混合均匀，作成1:100的稀释液。

③另取lmL灭菌吸管，按上项操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支lmL灭菌吸管。④根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移lmL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。⑤稀释液移入平皿后，应及时将凉至46

℃营养琼脂培养基[可放置于(46±1)℃水浴保温]注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有lmL稀释液(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。⑥待琼脂凝固后，翻转平板，置(36±1)℃温箱内培养(48±2)h。(2)菌落计数方法作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。(3)菌落计数的报告①平板菌落数的选择。选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)，若仅有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。

②稀释度的选择

a．应选择平均菌落数在30—300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之(见表11-1例1)。

b．若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30—300之间，则视二者之比如何来决定，若其比值小于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字(见表11-1例2及例3)。

c．若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表11-1例4)。

d．若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表11—1例5)。

e．若所有稀释度均无菌落生长，则以小于(<)1乘以最低稀释倍数报告之(见表11-1例6)。

f．若所有稀释度的平均菌落数均不在30—300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表11-1，例7)。③菌落数的报告。菌落数在100以内时，按其实有数据报告；大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示(见表11—1“报告方式”栏)。5．注意事项为了正确地反映食品中各种需氧和兼性厌氧菌存在的情况，检验时必须遵循以下一些要求和规定。(1)所用器皿及稀释液①检验中所用玻璃器皿，如培养皿、吸管、试管等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。②用作样品稀释的液体，每批都要有空白对照。如果在琼脂对照平板上出现几个菌落时，要追加对照平板，以判定是空白稀释液，用于倾注平皿的培养基，还是平皿、吸管或空气可能存在的污染。

③检样的稀释液虽可用灭菌盐水或蒸馏水，但以用磷酸缓冲盐水特别是0.1％蛋白胨水为合适，因蛋白胨水对细菌细胞有更好的保护作用；不会因为在稀释过程中而使食品检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。如果对含盐量较高的食品(如酱品等)进行稀释，则宜采用蒸馏水。(2)检样稀释①检样稀释时，应以无菌手续称取(或量取)有代表性的样品25g(或mL)剪碎放于含有225mL灭菌稀释液的玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇作成1:10的稀释液。如系肉、鱼等固体样品，最好剪细于灭菌乳钵内与稀释液研匀，或与稀释液同置于灭菌均质器杯中(国产均质器，目前以江苏武进郑陆医学仪器厂产品较简便而实用)，以8000～10000r／min速度搅拌lmin；使做成均匀的1:10稀释液。②根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，将上述1:10的检样稀释液再做成几个适当的10倍递增稀释液。即取1:10稀释掖1mL与9mL稀释液混合做成1:100的稀释液，然后依次递增稀释，做成1:1000、1:10000等稀释液。注意每递增稀释一次，必须另换一支1mL灭菌吸管，这样所得检样的稀释倍数方为准确。③从吸管筒内取出灭菌吸管时，不要将吸管尖端碰着其它仍留在容器内的吸管的外露部分；而且吸管在进出装有稀释液的玻璃瓶和试管时，也不要触及瓶口及试管口的外侧部分；因为这些部分都可能接触过手或其它沾污物。

④在做10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液面2.5cm；吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸管内液体调至所要求的刻度，这样取样较准确,而且在吸管从稀释液内取出时不会有多余的液体黏附于管外。⑤当用吸管将检样稀释液加至另一装有9mL空白稀释液的管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧部分黏附的检液也混入其中。

(3)平板接种与培养①将稀释液加至灭菌平皿内时，应根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移lmL稀释液加入皿内(从皿侧加入，不要揭去皿盖)，最后将吸管直立使液体流毕，并在皿底干燥处再擦一下吸管尖将余液排出，而不要吹出。每个稀释度应作2个平皿。②用于倾注平皿的营养琼脂应预先加热使融化，并保温于(45±1)℃恒温水浴中待用。倾注平皿时，每皿内倾入约15mL，最后将琼脂底部带有沉淀的部分弃去。

③为了防止细菌增殖及产生片状菌落，在检液加入平皿后，应在20min内倾入琼脂，并立即使其与琼脂混合均匀。④检样与琼脂混合时，可将皿底在平面上先向一个方向旋转，然后再向相反的方向旋转，以使充分混匀。旋转中应加小心，不要使混合物溅到皿边的上方。为了保证混合均匀，而不溅及皿边的上方，可使用江苏省无锡县卫生防疫站童鹤泉设计制成的自动平皿旋转仪，直接将加有检样的平皿放在旋转仪上(可同时放4只平皿)，加入琼脂后，开动电钮，在数十s内即可自动左右旋转而使皿内的检样与琼脂混合匀。⑤皿内琼脂凝固后，不要长久放置，然后使翻转培养；而应于琼脂凝固后，在数分钟内即应将平皿翻转予以培养，这样可避免菌落蔓延生长。必要时，可先将皿打开倒置(皿底向上)于温箱内经15～60min使琼脂表面干燥后，再将皿底移至盖内倒置于温箱内培养。这样可以阻止运动性强的变形杆菌属、假单孢菌属和芽孢杆菌属中一些菌株在琼脂表面扩展生长。⑥为了控制污染，在取样进行检验的同时，于工作台上打开一块琼脂平板，其暴露的时间，应与该检样从制备、稀释到加入平皿时所暴露的最长的时间相当，然后与加有检样的平皿一并置于温箱内培养，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。

⑦培养温度，应根据食品种类而定。肉、乳、蛋类食品用37℃培养，水产品用30℃培养。培养时间为(48±2)h。其它食品，如清凉饮料、调味品、糖果、糕点、果脯、酒类(主要为发酵酒)、豆制品和酱腌菜均系用37℃，(24±2)h培养。培养温度和时间之所以有所不同是因为在制定这些食品卫生标准中关于菌落总数的规定时，分别采用了不同的温度和培养时间所取得的数据之故。水产品因来自淡水或海水，水底温度较低，因而制定水产品细菌方面的卫生标准时，系用30℃作为培养的温度。(4)对照试验①加入平皿内的检样稀释液(特别是10-1的稀释液)，有时带有食品颗粒，在这种情况下，为了避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与琼脂混合的平皿，不经培养，而于4℃环境中放置，以便在计数检样菌落时用作对照。②为了防止检样中食品颗粒与菌落混淆，也可在已溶化而保温于45℃水浴内的琼脂中，按每100mL加1mL0.5％氯化三苯四氮唑(2，3，5—TTC)水溶液。培养后，如系食品颗粒，不见变化，如为细菌，则生成红色菌落。配好的TTC溶液，应先用来与不加TTC的作对照，以观察其对计数是否有不利的作用(TTC在一定浓度下对革兰氏阳性菌有抑制作用)。

TTC溶液要放冷暗处保存，以防受热与光照而发生分解。无色的TTC是作为受氢体加入培养基中，如果有细菌存在，培养后，在细菌脱氢酶的作用下，TTC便接受氢而成为红色的三苯基甲，使菌落呈现红色。(5)菌落计数①从温箱内取出平皿进行菌落计数时，应先分别观察同一稀释度的两个平皿和不同稀释度的几个平皿内平板上菌落生长情况。平行试验的2个平板与菌落数应该接近，不同稀释度的几个平板上菌落数则应与检样稀释倍数成反比，即检样稀释倍数越大，菌落数越低，稀释倍数越小，菌落数越高。②计数菌落时，应选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定的标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数；如其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。如在一个稀释度的两个平板中，一个平板的菌落数在30～300之间，另一个大于300或小于30时，则以菌落数在30～300间的平板作为计数的标准。③菌落计数所得结果，可分别按以下几种不同情况作报告。

a．若1个稀释度的平均菌落数在30～300之间，则将该菌落数乘其稀释倍数报告之，如表11—1中例1，报告为:164×102=16400，或1.6×104b.若有2个稀释度，其生长的菌落数均在30—300之间，则视二者之比如何来决定。若其比值小于2，应报告其平均数，如表11-1中例2：46000／29500=1.6<2，故报告为：(46000+29500)／2=37750或3.8×104。若大于2，则报告其中较小的数字，如表11—1例3:60000／27100=2.272，故报告为：27100或2.7×104。c．若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之，如表11—1中例4，报告为313×103=313000或3.1×105。d．若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之，如表11—1中例5，报告为27×10=270或2.7×102。e．若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1(<1)乘以最低稀释倍数报告之，如表11—1中例6，报告为：<1×10，或<10。f．若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之，如表11—1中例7，报告为305×102=30500或3.1×104。④如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高，则系检验工作中发生的差错，属实验案事故。此外，也可能因抑菌剂混入样品中所致，均不可用作检样计数报告的依据。⑤如果平板上出现链状菌落，菌落之间没有明显的界限，这是在琼脂与检样混合时，一个细菌块被分散所造成的。一条链作为一个菌落计，如有来源不同的几条链，每条链作为一个菌落计，不要把链上生长的各个菌落分开来数。此外，如皿内琼脂凝固后未及时进行培养而遭受昆虫侵入，在昆虫爬过的地方也会出现链状菌落，也不应分开来数。⑥如果所有平板上都菌落密布，不要用多不可计作报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中2个cm2中的菌落数，除2求出每cm2内平均菌落数，乘以皿底面积63.6cm2，再乘其稀释倍数作报告。例如10-1～10-3稀释度的所有平板上均菌落密布，而在10-3稀释的平板上任意数2个cm2内的菌落数是60个，皿底直径为9cm，则该检样每g(或mL)中“估计”菌落数为：(60／2)×63.6×1000=1908000或1.9×10663.6cm2系按皿底直径为9cm时计算而得，即：(9／2)2

×3.14=63.6；如所用平皿的皿底直径不是9cm，则可按其直径的实际cm数代入圆面积公式求出。⑦菌落计数中，如能使用国产JLQ—S2型菌落计数器(江苏武进郑陆医学仪器厂产品)，则比较方便，灯光由侧面射向平板，菌落易于观察。由于仪器带有电子音响讯号，用特制金属探笔点数中，在发出音响之下始显示数字增加，不会发生差错。且灯光与平板之间夹有多用方格玻质规板(方格面积为1cm2)，也有助于对菌落密布的平板进行计数。⑧检样如系微生物类制剂(如酸牛乳、酵母制酸性饮料)，则平板计数中应相应地将有关微生物(乳酸杆菌、酵母菌)排除，不可并入检样的菌落总数内作报告。一般在校正检样的pH至7.6后，再进行稀释和培养，此类嗜酸性微生物往往不易生长，并可以用革兰法染色鉴别。

染色鉴别时，要用不校正pH的检样做成相同稀释度的稀释液培养所生成的菌落涂片染色作对照，以资辨别。酵母菌卵圆形，远比细菌大，大小为(2～5)×(5～3)μm，革兰氏阳性着色。乳酸杆菌在24h内，于普通营养琼脂平板上在有氧条件下培养，通常是不生长的。(6)报告方式①当检样的菌落数为1～100时，按实有数报告；大于100时，只记录左面头两位数字(用两位有效数字作报告，可避免产生虚假的精确概念)，左面第三位数字则用四舍五入法计算，从第二位数字之后都记为0，为了缩短数字后面的0数，也可用10的指数来表示，例如菌落数为37750时，即可写成3.8×104(见表11—1中“报告方式”栏)。

②检样的菌落数如系从菌落密布的平板上按比例计算而求得，报告结果时，应在菌落数前加上“估计”二字(见上述菌落计数⑥中所举之例)。③检样为固体，用重量法取样检验时，以g为单位报告其菌落数；检样为液体，用容量法取样检验时，以mL为单位报告其菌落数；如检样为样品表面的涂擦液，则应以cm2为单位报告其菌落数。④如检样为液体，在两个平皿内所加lmL未经稀释的检样(原液)培养中均无细菌集落生成，则报告为lmL检样内未有菌落生长，或lmL检样内菌落数<1。二、大肠菌群测定大肠菌群系指一群在37℃、24h能发酵乳糖、产糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。食品中大肠菌群数系以每100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。1．设备和材料温箱：(36±1)℃；水浴：(44±0.5)℃；天平；显微镜；均质器或乳钵；温度计；平皿；试管；吸管；载玻片；发酵倒管。

2．培养基和试剂乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂、乳糖发酵管、革兰氏染色液。3．检验程序大肠菌群检验程序如下：4．操作步骤(1)检样稀释①以无菌操作将检样25mL(或25g)放于含有225mL灭菌生理盐水或其它稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8000～10000r／min的速度处理lmin作成1:10的均匀稀释液。②用lmL灭菌吸管吸取1：10稀释液lmL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内，振摇试管混匀，作成1:100的稀释液。③另取lmL灭菌吸管，按上项操作依次作10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支lmL灭菌吸管。

④根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。(2)乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在lmL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管：lmL及lmL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置(36±1)℃温箱内，培养(24±2)h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。(3)分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置(36±1)℃温箱内，培养18～24h，然后取出，观察菌落形态，并作革兰染色和证实试验。

(4)证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰染色，同时接种乳糖发酵管，置(36±1)℃温箱内培养(24±2)h，观察产气情况，凡乳糖管产气、革兰染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。(5)报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表(表11-2)，报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。5．粪大肠菌群(faecalcoliform)(1)检样稀释见4．(1)。(2)44℃乳糖发酵试验将检样以无菌操作接种于乳糖胆盐发酵管内(1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；lmL及lmL以下者，可用单料乳糖胆盐发酵管)，置(44±0.5)℃水浴内，培养(24±2)h，经培养后，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为阴性。如有产气者，则按下列程序进行。(3)证实试验将所有产气发酵管，分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置(36±1)℃培养18～24h，并同时接种蛋白质试剂约0.5mL，观察靛基质反应。

(4)结果评定凡靛基质阳性，平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。(5)报告根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)粪大肠菌群的最可能数。6．注意事项(1)检验步序

a.大肠菌群的检验步序采用三步法(乳糖发酵试验、分离培养和证实试验)。第一步乳糖发酵试验是样品的发酵结果，不是纯菌的发酵试验，所以初发酵阳性管，经过平板分离和证实试验后，有时可能成为阴性。

b.大量检验数据表明，食品中大肠菌群检验步序的符合率，初发酵与证实试验相差较大，不同食品三步序的符合情况也不一致(见表11—3)。

c.所以在大肠菌群检验步序方面，应结合食品类别、污染情况以及样品中菌相的差异分别予以考虑。

d.在食品检验上，除个别情况外，一般来说，如果平板上有较多典型大肠菌群菌落，革兰染色为阴性杆菌，即可做出判定。

e.如平板上典型菌落甚少或均不够典型，则应多挑菌落做证实试验，以免出现假阴性。只做一步初发酵，对某些食品来说，误差是比较大的。这样做，会有相当的合格样品被做为不合格样品处理，应予注意。(2)抑菌剂

a.大肠菌群检验中经常使用的抑菌剂有胆盐、洗衣粉、十二烷基硫酸钠、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。

b.有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有差误，即可对抑菌作用产生影响。

c.有的抑菌剂当批号、规格改变时，也可影响抑菌效果，而需重新测定抑菌的有效剂量。这些情况均给抑菌剂的使用带来不利条件。d.我们曾对胆盐等三种抑菌剂进行大肠菌群检验效果的观察(见表11-4)。目前我国在食品大肠菌群检验方面采用胆盐作为抑菌剂，猪、牛、羊三种胆盐对大肠菌群的检验效果，经实验观察无何明显差异，可相互替代。e.但其它胆盐的检验效果则不一致(见表11-5)，故不宜相互替代。目前由于胆盐不易购买，有的实验室以3号胆盐、混合胆盐、去氧胆酸钠或免胆盐等代替猪胆盐加入培基中，这会影响大肠菌群的检验结果，应予注意。f.在胆盐用量上，实验表明1％、0.5％和0.25％三个剂量无任何差异。所以目前乳糖发酵管采用的胆盐剂量(0.5％)是适宜的，在称量时稍有差误，亦不致影响大肠菌群的检出。(3)挑选菌落

a.大肠菌群是一群肠道杆菌的总称，大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠杆菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。所以在实际工作中，为了提高大肠菌群的检出率，应当熟悉大肠菌群的菌落色泽和形态。在检验方法中我们选用伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽，检出率为最高；红色、粉色菌落检出率较低。菌落形态的其它方面(如菌落大小、光滑与粗糙、边缘完整情况、隆起情况、湿润与干燥等)虽亦应注意，但不如色泽方面更为重要(见表11-6、表11-7)。

b.挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，在实际工作中，由于工作量较大，通常只挑取一个菌落，但影响大肠菌群检出率的因素较多，如食品种类，菌落色泽和形态、细菌种类等，所以只挑一个菌落，由于几率问题，很难避免假阴性的出现，尤其当菌落呈不典型时(见表11—8)。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。(4)产气量

a.在糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内存有极微小的气泡(有时比小米粒还小)，类似这样的情况能否算作产气阳性，这是许多食品检验工作者经常遇到的问题。大肠菌群协作组在这方面进行了实验观察。

b.结果表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生小于米粒的气泡。一般来说，产气量与大肠菌群检出率呈正相关，但随样品种类而有不同，有小于米粒的气泡，亦可有阳性检出。

c.另外，对未产气的乳糖发酵管是否均应作阴性处理，根据大量工作实践来看，对这种情况应予慎重考虑，在日常工作中，经常可以遇到在初发酵时产酸无气，但复发酵却证实为大肠菌群阳性。有时倒管内虽无气体，但在液面及管壁却可以看到缓缓上浮的小气泡。

d.所以对未产气的乳糖发酵管如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步观察。这种情况的阳性检出率可达半数以上(见表11-9)。(5)MPN检索表最可能数(MPN)是表示样品中活菌密度的估测。MPN检索表(见表11-2)是采用三个稀释度九管法，稀释度的选择是基于对样品中菌数的估测，较理想的结果应是最低稀释度3管为阳性，而最高稀释度3管内阴性。如果无法估测样品中的菌数，则应做一定范围的稀释度。这次提供的MPN检索表列出了95％可信限，供使用者参考。在查阅MPN检索表时，应注意以下几个问题。①这次提供的MPN检索表和部颁法(1976版)不同，只给了三个稀释度，即1mL(g)、0.1mL(g)、0.01mL(g)、如欲改用10mL(g)、lmL(g)、0.1mL(g)或0.1mL(g)、0.01mL(g)、0.001mL(g)时，则表内数字应相应降低或增加10倍，其余可类推。

②在MPN检索表第一栏阳性管数下面列出的mL(g)，系指原样品(包括液体和固体)的mL(g)数，并非样品稀释后的mL(g)数，对固体样品更应注意。如固体样品1g经10倍稀释后，虽加入1mL量，但实际其中只含有0.1g样品，故应按0.1g计，不应按lmL计。③当检索表内三个稀释度检测结果都是阴性时，MPN值应按<3判定，这样更能反映实际情况。例如11.1mL(g)和1.11mL(g)两个检测剂量，当它们都是阴性时，如都按0处理，则两组样品量虽相差10倍，但MPN值却无法区分，实际上两个0的含义并不相等。如按<3和<30处理，则MPN值能反映出两组所用样品量的不同，实际上11.1mL(g)应为<3，而1.11mL(g)应为<30，二者还是有区别的。所以用<3和<30处理，更反映实际情况。第三节常见致病菌检验一、葡萄球菌检验食品中生长金黄色葡萄球菌是食品卫生上的一种潜在危险，因为金黄色葡萄球菌可以产生肠毒素，食后能引起食物中毒。因此，检查食品中金黄色葡萄球菌有实际意义。1．设备和材料显微镜；温箱：(36±1)℃；离心机；灭菌吸管：1、5、10mL；灭菌试管；载玻片；酒精灯。2．培养基和试剂7.5％氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird—Parker氏培养基、肉浸液肉汤、灭菌盐水、兔血浆。3．检验程序葡萄球菌检验程序如下：4．操作步骤(1)一般培养将上述混悬液(25g检样加225mL灭菌生理盐水)或液体检样吸取5mL接种于7.5％氯化钠肉汤50mL，同时挑取混悬液接种血平板及Baird-Parker氏培养基，置(36±1)℃温箱培养24h，7.5％氯化钠肉汤经增菌后转种上述平板。挑取金黄色葡萄球菌菌落进行革兰染色镜检及血浆凝固酶试验。(2)形态本菌为革兰阳性球菌，排列呈葡萄状，无芽孢，无荚膜，致病性葡萄球菌，菌体较小，直径约为0.5～1μm。

(3)培养特性在肉汤中呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker氏培养基上为圆形，光滑，凸起，湿润，直径为2—3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带在其外层有一透明带。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明带。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。(4)血浆凝固酶试验吸取1:4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5mL振荡混匀，放(36±1)℃温箱或水浴内每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝块即为阳性。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌菌株及肉浸液肉汤作为对照。5．注意事项(1)增菌培养一般用7.5％氯化钠肉汤增菌。Giolitti和Cantoni应用加有亚碲酸钾、氨基乙酸等试剂的Giolitti-Cantoni肉汤，增菌食品样品中的葡萄球菌，效果较好。37℃培养24h。(2)分离培养用Baird-Parker平板和血平板进行划线接种。(3)分纯培养在Baird-Parker平板上挑取圆形、光滑、凸起、湿润、直径为2～3mm，颜色呈灰黑色到黑色菌落，菌落周围有一混浊带在其外层有一透明圈。偶然也会遇到无混浊带和透明圈的菌落。在血平板上菌落呈现金黄色(个别有白色)，大而突起，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。进行分纯培养，37℃培养24h，进行革兰染色，如为革兰氏阳性葡萄状排列，进行生化试验，肠毒素分型，噬菌体分型等试验。

(4)生化试验葡萄球菌触酶阳性，与链球菌相区别，一般对糖发酵不规则，多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，产酸不产气，致病性葡萄球菌在厌氧条件下能分解甘露醇，产酸，非致病性葡萄球菌无此作用。

二、溶血性链球菌检验链球菌在自然界分布较广，可存在于水、空气、尘埃、牛奶、粪便及人的咽喉和病灶中，根据其抗原结构，族特异性“C”抗原的不同，可进行血清学分群，按其在血平板上溶血的情况可分为甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌和丙型溶血性链球菌。与人类疾病有关的大多属于乙型溶血性链球菌，其血清型90％属于A群链球菌，常可引起皮肤和皮下组织的化脓性炎症及呼吸道感染，还可通过食品引起猩红热、流行性咽炎的暴发性流行。

1．设备和材料温箱：(36±1)℃；水浴箱：(36±1)℃；显微镜；离心机；试管架；灭菌平皿；灭菌小试管；载玻片；灭菌吸管：lmL、5mL；灭菌镊子。2．培养基和试剂葡萄糖肉浸液肉汤(在肉浸液肉汤内加入1％葡萄糖)、匹克氏肉汤、血琼脂、人血浆、0.25％氯化钙。灭菌生理盐水。杆菌肽药敏纸片(含0.04单位)。3．检验程序溶血性链球菌检验程序如下图4．操作步骤(1)检样处理称取25g固体检样，加入225mL灭菌生理盐水，研成匀浆制成混悬液；液体检样可直接培养。(2)一般培养将上述混悬液或液体检样直接划线于血平板，并吸取5mL接种于50mL葡萄糖肉浸液肉汤内，如检样污染较严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经(36±1)℃培养24h，接种血平板，置(36±1)℃培养24h，挑取乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。(3)形态与染色本菌呈球形或卵圆形，直径0.5～lμm，链状排列，链长短不一，短者4～8个细胞组成，长者20～30个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链；在固体培养基中常呈短链；不形成芽孢，无鞭毛，不能运动。(4)培养特性该菌营养要求较高，在普通培养基上生长不良，在加有血液、血清培养基中生长较好。溶血性链球菌在血清肉汤中生长时，管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落呈灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直径约0.5～0.75mm，为圆形突起的细小菌落，乙型溶血性链球菌周围有2～4mm界限分明、无色透明的溶血圈。(5)链激酶试验致病性溶血性链球菌能产生链激酶(即溶纤维蛋白酶)，此酶能激活正常人体血液中血浆蛋白酶原，使成血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。

吸取草酸钾血浆0.2mL(草酸钾0.0lg，加入5mL人血混匀，经离心沉淀吸取上清液即为血浆)，加入0.8mL灭菌生理盐水，混匀，再加入18～24h链球菌肉汤培养物0.5mL及0.25％氯化钙0.25mL，振荡摇匀。置(36±1)℃水浴中每隔数分钟观察一次(一般约l0min即可凝固)，血浆凝固后，再注意观察及记录溶化的时间。溶化时间愈短，表示该菌产生的链激酶愈多，含量多时，20min内凝固的血浆即完全溶解。如无变化，应在水浴中持续放置2h，24h后再观察，如凝块全部溶解为阳性，24h后仍不溶解者为阴性。

(6)杆菌肽敏感试验挑取乙型溶血性链球菌浓菌液，涂布于血平板(肉浸液琼脂加入5％血)上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，于(36±1)℃培养18～24h，如有抑菌带出现即为阳性，可初步鉴定为A群链球菌，同时用已知阳性菌株作为对照。5．注意事项(1)增菌培养一般用匹克肉汤或葡萄糖肉浸液肉汤，有的学者在葡萄糖肉汤内加有Lablemco粉，增菌效果好。匹克肉汤含有胰蛋白胨的心肌浸液和脱纤维血，营养丰富，含有三氮化钠抑制革兰阴性细菌生长，一般用于污染严重的标本。接种后经37℃培养24h。

(2)分离培养将上述增殖的培养物接种于血琼脂平板，有的学者应用三氮化钠平板分离效果也较好。分离后37℃培养24h。(3)分纯培养挑取血平板上灰白色、半透明或不透明、表面光滑小的菌落，菌的周围有透明环的单个菌落，进行分纯培养，37℃培养24h，进行革兰染色，如为革兰阳性链状排列球菌，进行生化试验和血清学试验。(4)生化试验①溶纤维蛋白酶试验(链激酶)：抽取人血l0mL，放入已加有无菌0.02g草酸钾试管内，混合之，置于2000r／min离心机内旋转l0min，吸取血浆进行试验。取血浆0.2mL，加0.8mL盐水混合，再加入链球菌24h肉浸液肉汤培养物0.5mL。

然后再加入0.25％氯化钙(分析纯)0.25mL，混合后放37℃水浴，注意血浆完全凝固时间(约15min)。凝固后每半小时观察一次结果，记录完全凝固和溶解时间，共观察2h，不溶解者仍放水浴，24h后再观察一次。另用0.5mL肉浸液肉汤作为阴性对照，用已知链激酶阳性菌株肉浸肉汤培养物0.5mL作为阳性对照。致病性溶血链球菌链激酶应为阳性。做该项试验注意人血浆应新鲜。②杆菌肽敏感试验，将分纯的乙类溶血链球菌划线接种于血琼脂平板，以无菌手续将每片内含有0.04单位的杆菌肽纸片贴附于上述划线处。37℃培养18h，如产生抑菌圈即为对杆菌肽敏感，对杆菌肽敏感的菌株99.5％为A族链球菌，另外还有6％B族；7.5％C族和G族链球菌也对杆菌肽敏感，因此当该项试验阳性时，可推测为乙类溶血性A族链球菌。

三、沙门菌检验沙门菌病常在动物中广泛传播，人的沙门菌感染和带菌也非常普遍。由于动物的生前感染或食品受到污染，均可使人发生食物中毒。在世界各地的食物中毒中，沙门菌食物中毒常占首位或第二位。食品中沙门菌的含量较少，且常由于食物加工过程使其受到损伤而处于濒死的状态。故为了分离食品中的沙门菌，必须将增菌方法作某些改进。同时，由于分类学的改变，过去所称“亚利桑那菌属”现已与沙门菌属合并，列为亚属Ⅲ，因此，分离与鉴定的方法应作相应的改变。

目前用于食品中沙门菌的检验方法，包括五个基本步骤：(1)前增菌，用无选择性的培养基使处于濒死状态的沙门菌恢复其活力；(2)选择性增菌，使沙门菌得以繁殖，而大多数的其它细菌受到抑制；(3)选择性平板分离沙门菌；(4)生化试验，鉴定到属；(5)血清学分型鉴定。1．设备和材料天平：称取检样用；均质器或乳钵；温箱：(36±1)℃、42℃；显微镜；灭菌广口瓶：500mL；灭菌三角烧瓶：250mL；灭菌吸管：l0mL；灭菌平皿：皿底直径9cm；灭菌小玻管：内径3mm，长约5cm；灭菌毛细吸管及橡皮乳头；载玻片；酒精灯；灭菌金属匙或玻璃棒；接种棒、镍铬丝；试管架。2．培养基和试剂缓冲蛋白胨水(BP)、氯化镁孔雀绿(MM)增菌液、四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液、亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液、亚硫酸铋琼脂(BS)。DHL琼脂、HE琼脂、SS琼脂、三糖铁琼脂(TSI)、蛋白胨水、靛基质试剂、尿素琼脂(DHTZ)、氰化钾(KCN)培养基、氨基酸脱羧酶试验培养基、糖发酵管、ONPG培养基、半固体琼脂、缓冲葡萄糖蛋白胨水、甲基红试剂、V-P试剂、丙二酸钠培养基、氧化酶试验、革兰氏染色液、沙门菌因子血清：用于初步分型有26种，一般分型有57种，详细分型有144种。3．检验程序沙门菌检验程序如下：4．操作步骤(1)前增菌和增菌冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品均应经过前增菌。各称取检样25g，加在装有225mL缓冲蛋白胨水的500mL广口瓶内。固体食品可先应用均质器，以8000～10000r／min打碎lmin，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用灭菌匙或玻璃棒研磨使乳化。于(36±1)℃培养4h(干蛋品需培养18—24h)，移取l0mL，转种于l00mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42

℃培养18—24h。同时，另取l0mL，加入于l00mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于(36±1)℃培养18—24h。

鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其它未经加工的食品不必经过前增菌。各取25g(25mL)加入灭菌生理盐水25mL按前法做成检样匀液，取其半量接种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养24h；另半量接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于(36±1)℃培养18～24h。(2)分离取增菌液1环，划线接种于亚硫酸铋琼脂平板一个和DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、或SS琼脂平板)一个。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于(36±1)℃分别培养18—24h(DHL、HE、SS)或40～48h(BS)。观察各平板上生长的菌落，沙门菌属亚属Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、V和亚属Ⅲ在各个子板上的菌落见表12—1。

(3)生化试验①挑取选择性平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂。一般应多挑几个菌落，以防遗漏。在三糖铁琼脂内，各个菌属的主要反应结果见表12-2。

表12—2说明在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢(H2S)阴性的菌株可以排除，其它的反应结果均有沙门菌的可能，同时也均有不是沙门菌的可能，因此都需要做几项最低限度的生化试验。必要时作抹片染色镜检应为革兰阴性短杆菌，作氧化酶试验应为阴性。②在接种三糖铁琼脂的同时，再接种蛋白胨水(供作靛基质试验)、尿素琼脂，(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管，于(36±1)℃培养18—24h，必要时可延长至48h，按表12-3判定结果。按反应序号分类，沙门菌属的结果应属于A1、A2和B1，其他五种反应结果均可以排除。

沙门菌的检验可做至上述初步生化鉴定。必要时可将初步鉴定所分离的菌种及实验记录送至上级检验部门，做进一步鉴定。5．注意事项(1)前增菌、增菌和分离细菌受冷冻、加热、干燥、高渗、酸碱、辐射等的影响，可导致亚致死性的损伤，如给予适当的营养和温度，很快即能恢复，故经过冷冻或加工的食品，一般要选经过非选择性的前增菌。经过前增菌再进行选择后的增菌一般比直接增菌有更高的阳性检出率。目前常用于前增菌的培养基为缓冲蛋白胨水和乳糖肉汤，两种培养基的效果无显著差异。未经加工的生食品或污染严重的食品，直接选用选择性增菌。选择性增菌培养基，目前仍以亚硒酸盐肉汤、四硫磺酸盐肉汤和氯化镁孔雀绿肉汤为好。亚硒酸盐肉汤选择作用的机制可能是由亚硒酸钠与某些硫化物反应生成硒基连多硫酸盐或其它硒硫化合物所致。胱氨酸是较好的硫源，故在美国被推荐加入于增菌肉汤中。四硫磺酸盐肉汤的选择作用，取决于硫代硫酸钠和碘的平衡(Na2S203·5H20+I2→Na2S406+2NaI+5H2O)，碘液的加入量要经过严格的计算，配合后进行分装，并当时使用。氯化镁孔雀绿肉汤也是一种很好的沙门菌增菌培养基，但对伤寒沙门菌不利，近年来在原配方基础上又有所改进，形成了RV增菌肉汤和R10增菌肉汤。选择性培养的温度，一般认为在43

℃时可增加沙门菌的检出率，但对伤寒沙门菌和雏沙门菌不利。

选择性琼脂平板、目前认为以亚硫酸铋琼脂(BS)最好；其次为木糖赖氨酸琼脂(XLD)、Hektoen琼脂(HE)、煌绿琼脂(BG)；而以SS琼脂为最差。新介绍的含硫胆盐乳糖琼脂(DHL)的效果优于HE琼脂。关于食品中沙门菌的增菌、分离等各个阶段的方法学，国内已有很好的综述。由于XLD琼脂和HE琼脂成本昂贵，国内难以普遍使用。HE琼脂的H2S指示系统是非常好的，国内纷纷以此为基础，取得了良好的效果。(2)生化学鉴定20世纪40年代用于沙门菌的生化试验项目过于简单，大量生化特性相似的菌株无法鉴别。50年代开始，新的生化试验项目不断产生，但尚未在实际工作中应用。1962年在蒙德利尔召开的国际细菌分类命名委员会肠杆菌科小组委员会会议，为推广新的生化试验项目奠定了良好的基础。天津商品检验局

于1958年报告了采用KCN试验鉴别柠檬酸杆菌和沙门菌。但由于文革十年动乱，大量的新的生化试验项目尚未被国内的同行们所熟知。国内推广沙门菌的新的生化试验项目，是在20世纪70年代的中后期。1976年出版的《食品卫生检验方法(微生物学部分)》第二版中，鉴定沙门菌所用的一般生化试验项目，仍是40年代的老方法，而书中所介绍的系统生化试验项目，则是以肠杆菌科小组委员会1962年公布的定义为准，必须做完28项生化项目方能作出沙门菌属的鉴定结论。而且必要时还要加做ONPG试验（β—半乳糖苷酶试验）或5％乳糖发酵，甚至还要做考夫曼所推荐的5项有机酸盐试验。由于试验项目过多，给实际工作带来很大的不便。

1983年在《食品卫生检验方法(微生物学部分)》第三版中起草了第二个肠杆菌科各属简化诊断表。列入本表的必要的生化项目只有五项，即是H2S、靛基质、pH7.2尿素酶、KCN和赖氨酸脱羧酶。对于H2S阳性的细菌，已足以正确鉴别沙门菌属和柠檬酸杆菌属；对于H2S阴性的细菌，查表到B1时，实际上只要补做ONPG试验（β—半乳糖苷酶试验），即可以正确鉴别沙门菌属和艾希菌属。这是沙门菌属生化学鉴定的最简单的，也是最佳的方案。

四、志贺菌检验志贺菌在食品中的存活期较短，目前仍缺少理想的增菌方法，但其重要性不可忽视。1．设备和材料天平：称取检样用；均质器或乳钵；温箱：(36±1)℃；显微镜；灭菌广口瓶：500mL；灭菌平皿：皿底直径9cm；酒精灯；载玻片；灭菌金属匙或玻璃棒；接种棒、镍铬丝；试管架。2．培养基和试剂

GN增菌液、HE琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂(EMB)、三糖铁琼脂(TSI)、半固体管、赖氨酸培养基、苯丙氨酸琼脂、西蒙氏柠檬酸盐培养基、葡萄糖铵培养基、糖发酵管、蛋白胨水、靛基质试剂、缓冲葡萄糖蛋白胨水、V-P试基、甲基红试剂、氧化酶试验、革兰氏染色液。

3．检验程序志贺菌检验程序如下。4．操作步骤(1)增菌称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内(固体食品应用均质器以8000～10000r／min打碎lmin，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品应用灭菌金属匙或玻璃棒研磨使其乳化)，于(36±1)℃培养6～8h。(2)分离取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板一个，麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板一个，于(36±1)℃培养18～24h。志贺菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。

(3)生化试验挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和半固体各一管。一般应多挑几个菌落以防遗漏。志贺菌属在三糖铁琼脂内的反应结果为底层产酸、不产气(福氏志贺菌6型可微产气)，斜面产碱，不产生硫化氢，无动力，在半固体管内沿穿刺线生长。具有以上特性的菌株，疑为志贺菌，可做血清凝集试验。在做血清学试验的同时，应进一步做V—P、苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶、西蒙柠檬酸盐和葡萄糖铵试验，志贺菌属均为阴性反应。必要时应做革兰染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰阴性杆菌，并以生化试验方法做4个生化群的鉴定，见表12-4。(4)血清学试验必要时，可将生化试验分群鉴定的菌种及实验记录，送至上级检验机构进行血清学鉴定。5．注意事项(1)志贺菌在常温存活期很短，因此，当样品采集后，应尽快进行检验。如果在24h内检验，样品可保存在冰箱内，如欲保存较长时间，必须放在低温冰箱内。宋内志贺菌和福氏志贺菌2a型，在牛乳和麦粉中，于—25℃可存活100d；在鸡蛋和水产品中于—20

℃可存活30d。(2)迄今没有很好的增菌培养基。目前仍然认为用GN肉汤增菌，以检查食品中和粪便中的志贺菌是有效的。

(3)增加鉴别培养基的数目，可以增加志贺菌的阳性检出率。用于分离的鉴别培养基一般不少于两个。中等选择性的，HE或SS琼脂平板一个；弱选择性的，麦康凯或EMB琼脂平板一个。WS琼脂可作为中等选择性培养基使用，FX琼脂可作为弱选择性培养基使用。(4)动力的观察非常重要。挑取可疑菌落，除接种一支三糖铁琼脂外，还要接种一支半固体琼脂。(5)下面的五项生化试验：V-P、苯丙氨酸、赖氨酸、柠檬酸盐和葡萄糖铵，是为了排除克雷伯菌族、变形杆菌族、以及无动力不产气的大肠艾希菌。应当着重注意鉴别的是无动力不产气的大肠艾希氏菌，其次是哈夫尼亚菌属和普罗菲登斯菌属。第四节真菌学检验一.霉菌和酵母菌数测定（一）常见产毒霉菌的观察常见产毒霉菌主要有曲霉属、青霉属和镰刀菌属中的一些种。要想从污染的食品中分离出这些霉菌，并鉴定到属或种，首先必须学会霉菌的分离鉴定技术，同时还要具备霉菌形态学方面的知识。对常见产毒霉菌的观察包括用肉眼观察和在显微镜下观察。肉眼观察的方法是将这些霉菌接种于斜面培养基上或将纯培养物点植于平板上，培养出一个完整的较大菌落，以供观察记录，这种方法叫大培养，主要是了解各种霉菌的培养性状和菌落特征。要想进一步了解霉菌的生长发育过程以及菌丝和孢子的形态特点，则采用小培养方法在显微镜下观察，或者从纯培养物上取材，制成压片，在显微镜下观察。具体实验方法见后面讲解，下面分别介绍一下主要产毒霉菌的形态结构。1、曲霉属本属的产毒霉菌主要包括黄曲霉、寄生曲霉、棕曲霉、杂色曲霉和构巢曲霉等。菌落特征：菌落颜色多种多样，但比较稳定。菌落质地多为丝绒状或絮状，有些菌种菌落表面有放射状沟纹。镜下结构：菌丝无色或有明亮的颜色，菌丝有横隔。附着在培养基表面的匍匐菌丝转化成厚壁细胞，称足细胞，在足细胞上长出直立的分生孢子梗。孢子梗的顶端膨大成顶囊，在顶囊的周围有辐射状排列的小梗(单层或双层)，如为两层，其内面一层称初生小梗(又称梗基)，外面一层称为次生小梗(又叫瓶梗)。小梗顶端产生一串分生孢子。常见产毒霉菌如下图：图

2、青霉属本属的产毒霉菌主要包括黄绿青霉、桔青霉、圆弧青霉、展开青霉、纯绿青霉、红色青霉、产紫青霉和岛青霉等。菌落特征：颜色大多数为青灰色、灰绿色。质地可为绒状、絮状、绳状和束状四种类型。有些种菌落表面有放射状沟纹或同心环，有的有渗出液。镜下结构：菌丝无色或有颜色，有横隔。分生孢子梗可由营养菌丝或气生菌丝生出。分生孢子梗的顶端形成帚状的分枝，称为帚状枝。帚状枝是本属的基本特征。根据帚状枝分枝的不同分为四种类型：(1)单轮生帚状枝；(2)二轮对称型帚状枝；(3)非对称型帚状枝；(4)多轮生帚状枝。帚状枝最后一级分枝，即产生分生孢子的细胞，称为瓶梗。产生瓶梗的细胞叫梗基。支持梗基的细胞叫副枝。瓶梗顶端产生分生孢子。常见产毒霉菌如下图：

3、镰刀菌属本属的产毒霉菌主要包括禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、雪腐镰刀菌、三线镰刀菌、梨孢镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和木贼镰刀菌等。菌落特征：菌落颜色多比较鲜艳，有粉红色、黄色、橙色、紫色等。质地疏松，多为絮状或绒状及粉状。

镜下结构：菌丝多无色透明，或有明亮鲜艳颜色。本属大多数种具有两种分生孢子。小分生孢子生于分生孢子梗上，形状多样，卵形、梨形、椭圆形和纺锤形等，少数有1-2个隔。大分生孢子产生在菌丝的短小爪状突起上或产生在分生孢子座上，或产生在粘孢团中。大分生孢子多种多样，可呈镰刀形、线形、纺锤形、披针形、弧形、柱形和锥形等，通常有3—5个分隔，少数种有6—9个分隔。大分生孢子的形态，大小和分隔数目是鉴定镰刀菌的重要依据。常见产毒霉菌如下图：（二）、霉菌和酵母计数各类食品由于遭到霉菌和酵母的侵染，常常使食品和粮食发生霉坏变质，有些霉菌的有毒代谢产物引起各种急性和慢性中毒，特别是有些霉菌毒素具有强烈的致癌性。实验证明，一次大量食入或长期少量食入，皆能诱发癌症。目前已知的产毒霉菌如青霉、曲霉和镰刀菌在自然界中分布较广，对食品的侵染机会亦多。因此，对食品加强霉菌的检验，在食品卫生学上具有重要意义。霉菌和酵母数的测定是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，测得1g或lmL检样中所含的霉菌和酵母菌落数(粮食样品是指1g粮食表面的霉菌总数)。霉菌和酵母数主要作为判定食品被霉菌和酵母污染程度的标志，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。本方法适用于所有食品。1、霉菌和酵母平板计数法（1）．设备和材料温箱：25～28℃；振荡器；天平；显微镜；玻塞三角瓶：300mL；试管：15×150mm；平皿：直径9cm；吸管：lmL及l0mL；酒精灯；载物玻片；盖玻片：广口瓶：121℃灭菌20min；牛皮纸袋：121℃灭菌20min；金属勺、刀等；试管架；接种针；橡皮乳头。（2）．培养基和试剂察氏培养基、高盐察氏培养基、马铃薯葡萄糖琼脂、马铃薯琼脂、孟加拉红培养基、玉米粉琼脂、灭菌蒸馏水、乙醇、乳酸一苯酚液。

（3）．检验程序霉菌和酵母数检验程序见下图。（4）．操作步骤

①采样取样时需特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口瓶，金属刀或勺等。在卫生学调查基础上，采取有代表性的样品。样品采集后应尽快检验，否则应将样品放在低温干燥处。粮食(包括粮库储粮，粮店或家庭小量存粮)样品的采集，可根据粮囤或粮垛的大小和类型，分层定点取样，一般可分三层五点，或分层随机采取不同点的样品，充分混合后，取500g左右送检。小量存粮可使用金属小勺采取上、中、下各部位的混合样品。

海运进口粮的采样：每一船仓采取表层、上层、中层及下层四个样品，每层从五点取样混合。如船仓盛粮超过1万吨，则应加采一个样品。必要时采取有疑问的样品送检。谷物加工制品(包括熟饭、糕点、面包等)、发酵食品、乳及乳制品以及其它液体食品，用灭菌工具采集可疑霉变食品250g，装入灭菌容器内送检。

②以无菌操作称取检样25g(或25mL)，放入含有225mL灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇30分钟，即为1:10稀释液。

③用灭菌吸管吸取1:10稀释液l0mL，注入试管中，另用带橡皮乳头的lmL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。

④取lmL1:10稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换一支lmL灭菌吸管吹吸5次，此液为1:100稀释液。

⑤按上述操作顺序作10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支lmL灭菌吸管，根据对样品污染情况的估计，选择3个合适的稀释度，分别在作10倍稀释的同时，吸取lmL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度作2个平皿，然后将凉至45℃左右的培养基注入平皿中，待琼脂凝固后，倒置于25～28℃温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。

⑥计算方法通常选择菌落数以10～150之间的平皿进行计数，同稀释度的2个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每g(或每mL)检样中所含霉菌和酵母数。

⑦报告每g(或每mL)食品所含霉菌和酵母数以个／g(个／mL)表示。2、霉菌直接镜检计数法一般以郝氏霉菌计测法为最常用。本方法适用于番茄酱罐头。（1）．设备和材料烧杯；玻璃棒；折光仪；显微镜；郝氏计测玻片：是一特制的，具有标准计测室的玻片；盖玻片；测微器：具标准刻度的玻片。

（2）．操作步骤

①检样的制备取定量检样，加蒸馏水稀释至折光指数为1.3447—1.3460(即浓度为7.9％一8.8％)备用。

②显微镜标准视野的校正将显微镜按放大率90～125倍调节标准视野。使其直径为1.382mm。

③涂片洗净郝氏计测玻片，将制好的标准样液，用玻棒均匀的摊布于计测室，以备观察。

④观测将制好之载玻片放于显微镜标准视野下进行霉菌观测，一般每一检样应观察50个视野，最好同一检样两人进行观察。

⑤结果与计算在标准视野下，发现有霉菌菌丝其长度超过标准视野(1.382mm)的1／6或三根菌丝总长度超过标准视野的1／6(即测微器的一格)时即为阳性(+)，否则为阴性(-)，按100个视野计，其中发现有霉菌菌丝体存在的视野数，即为霉菌的视野百分数。3、粮食霉菌的分离粮粒的内部和外部均有大量真菌存在，霉菌和酵母菌数的测定可反映粮食外部带菌情况，要想了解粮食内部霉菌侵染情况，一般采用直接平板法。[材料]小镊子、灭菌锥形瓶、灭菌试管、灭菌吸管、75％酒精、灭菌蒸馏水、高渗察氏培养基平板等。

[方法]（1）．粮粒表面除菌为了分离侵染内部的霉菌，在分离培养前，必须将附在粮粒表面的霉菌除去。粮粒表面除菌的方法是采用无菌水多次洗涤的方法。取粮食样品10—20g，放入灭菌的150ml锥形瓶中，以无菌技术，加入无菌水超过粮粒1—2cm左右，塞好棉塞充分振荡1-2min，将水倒净，再换水振荡，如此反复洗涤十次，最后将水弃去，将粮粒倒在无菌平皿中备用。如为原粮(如玉米、小麦等)须事先用75％酒精浸泡1-2min，以脱粮粒表面的蜡质，倾去酒精后，再用无菌水洗涤粮粒。（2）.粮粒接种方法

①粮粒直接接种法粮粒内部的霉菌分离主要应用此法。以无菌操作，用灭菌镊子将上述表面除菌的粮粒，胚部向下按等距离排列接种在高渗察氏琼脂平板上，接种时须将粮粒一部分插入培养基中。每块平板大粒(玉米、大豆等)者接种5粒，小粒者接种10粒，每份样品共接种50-100粒。接种完毕后，立即置28℃恒温箱培养一周。