霍乱弧菌样品采集及前处理课件

霍乱弧菌样品采集及前处理2012.9.20内容样品采集的总体要求样品种类采样方法及其注意事项样品前处理增加或改动内容两种新的水样采集方法Moore法（小体积水样）及Spira法（大体积水样）水样的前处理方法杂质少的水体、浑浊水体、海洋和河口水样食品的前处理方法贝类、鱼类、牡蛎样品种类粪便病人呕吐物尸体肠内容物粪便污染的衣物及相关物体表面如地面水体食品水生动物苍蝇采样方法一、

粪便标本一般采用自然留便，若采样时病人无便或婴幼儿则可采用肛拭法。尽可能在急性期、抗生素使用前采集新鲜粪便，样品采集后应尽快送检。留便：取自然排出的新鲜粪便，成形便采集约5g标本；水样便或典型的米泔水样便采集约5ml。肛拭法：先用无菌甘油水或生理盐水湿润棉签，多余的液体紧靠管壁挤出；再用棉拭或肛门采便管由肛门插入直肠内约3cm～5cm（幼儿约2cm～3cm）处，轻轻旋转360°，擦取直肠表面黏液后取出。避免采便量过少（注意棉签上应沾有粪便）。采样方法一、

粪便标本采肛拭子时应注意拭子大小是否适宜、光滑、结实且不易脱落。肛拭子标本如不能在2h内送达实验室，应插入Cary-Blair运送培养基运送，注意培养基应埋住粪便拭子，手接触的部分在管口折断弃去。采样方法二、

呕吐物和洗胃水患者如有呕吐，应尽量采集呕吐物。用无菌压舌板或棉拭子挑取少量呕吐物作为检材，放入自封塑料袋中并封好袋口或置于灭菌带盖瓶中，然后盖紧瓶盖，立即置于冷藏箱中。洗胃水置于灭菌容器内冷藏送检采样方法三、物体表面用灭菌棉拭蘸以灭菌生理水或碱性蛋白胨水涂擦被粪便污染的衣物、床单、食物操作台、砧板、地面等相关物体或怀疑污染物体表面，放入到装有少量生理盐水的采样管中，立即冷藏；或直接置于碱性蛋白胨水管中，常温下运往实验室。采样方法四、水体标本包括河口水、江河水、沟渠水、池塘水、湖水、井水、港湾海水、乡镇自来水厂源水、医院污水排放口、下水道排放口、海水产品养殖水、海水产品交易市场的出水口等。需要时也可采集水体的底泥作为检材。水样标本的采集方法有多种，各实验室应根据现场流行病学调查需要及实验室自身检测条件，如有无过滤器等等，作相应的选择。水源标本的采集方法2.Moore纱布集菌法：该方法尤其适用于河流等流动水水样的采集，但对于静止水无优势。城市生活污水的采集也可采用此法，该技术的敏感性似乎不取决于污染源与采样点的距离，应将采样装置放在各主要管道输入口处。Moore纱布集菌法取120cm×15cm纱布块（图-1），沿纱布长度方向折叠几次，在中心系一钓鱼绳(长1m以上)，为防止绳子被固定在树枝或其它物体上时被磨断，可以在绳子的末端系上一段金属细丝（图-1）。用牛皮纸包好，高压蒸汽灭菌备用。采样时，将纱布放在采水点的水中，然后将金属丝固定于岸边的树枝或其他物体上，放置24～48小时后，将带着水(约55ml)的纱布放入灭菌瓶中，置于冷藏箱后送到实验室。水源标本的采集方法2.Moore纱布集菌法：如果是采集医院污水排放口、下水道排放口、肉联厂加工的出厂水等水样时，应将纱布放在各个污水管道系统入口处，并仔细评估采样点周围可能抑制目标菌分离培养的各种因素。对于有倾倒腐败垃圾的污水系统进行采样时，应将纱布放在倾倒口的上游，以免有毒废弃物的污染，影响后续的病原体分离。水样采集后不能在3小时内送检者，应在采水点即将带水纱布加至增菌液中，摇匀，室温下运送至实验室。带水纱布与增菌液的体积之比应为10%～20%。水源标本的采集方法3.Spira纱布集菌法：用于过滤并采集大体积水样（约1.5升）。取500克的塑料瓶，在其底部掏一个2cm的洞（图-2）。洞的大小很关键，如果太大，水样过滤时会将纱布从孔中拉出来；如果太小又会引起水样过滤太慢。将120cm×180cm大小的纱布一层一层叠起来，折成30cm宽，放入带孔的塑料瓶中。既要使纱布相对比较结实又要使其仍有可压缩性，要能过滤大约瓶子体积的三分之二的水，而且要使水经过纱布过滤后流出去而不是从纱布旁边直接流出去。用牛皮纸将纱布包好，高压蒸汽灭菌后备用。将水样从瓶子的顶部注入并使其从底部流出。无菌操作取出纱布，放入盛有100ml10×浓缩增菌液的三角烧瓶或广口瓶中，补加水样至1L，混匀，室温下尽快送往实验室。采样方法五、食品针对不同的可疑食品，采集整体或部分标本，带至实验室。注意采集过程中不同食品不能交叉污染。采样方法六、水生动物选取活海水产品或涂抹拭子，置于塑料袋内（拭子标本可按粪便拭子保存运输方法处置），尽快送往实验室。如有成箱的海产品，则采取多个海产品的体表作为一个标本送检，这可能比只做一只海产品体内检查的阳性检出机会多。注意采集过程中不同海产品间不能交叉污染。样品前处理1.水样标本的前处理滤膜法：将杂质较少的被检水样１00ml，注入已灭菌的滤膜（0.45µm)滤器中抽滤后，将滤膜取下，置碱胨水增菌培养基中，35℃～37℃培养6～8小时后接种至TCBS或其它选择性平板吸附沉淀法：取水样450ml，先加入10%无菌碳酸钠溶液2ml及10%硫酸亚铁溶液1.7ml，混匀，静置50分钟，弃上清，取沉淀物约40～50ml，置50～100ml2×碱胨水增菌液中，35℃～37℃培养6～8小时后接种至TCBS或其它选择性平板样品前处理1.水样标本的前处理来自海洋和河口的水样，因其含有大量的其它弧菌，而这些弧菌在碱胨水中和TCBS平板上与霍乱弧菌生长得一样好。这些标本应作倍比稀释，使成10-1、10-2、10-3

，以减少竞争性微生物。然后将碱胨水放在42℃增菌，以抑制一些竞争者的生长，尤其是在该温度下生长得不好的其它弧菌。相反，淡水和生活污水在放入42℃培养前则不需要进行稀释特别脏的水体首先将10mL水样加入90mL碱性蛋白胨水中，使成10-1，然后再作系列稀释，制成10-2和10-3，将三个稀释度的水样分别置于37℃增菌培养6～8h。有条件时或检测需要时、还可制备平行样，然后将三个稀释度的水样分别置于42℃增菌。样品前处理2.水生动物标本处理因为牡蛎肉的某些成份对于O1群霍乱弧菌有毒性，因此一次只能处理少量牡蛎样品（10～12只），并且要尽快稀释，这样既能稀释其它微生物还能削弱牡蛎肉的杀菌作用有条件的实验室可以做平行样，分别放在35℃～37℃和42℃培养。42℃增菌可以大大增加分离霍乱弧菌的机率，对于牡蛎样品更是强烈推荐此法24小时pH4℃室温37℃O1O139O1O139O1O1396.4×1086.4×1041.7×1091.7×1056.4×1086.4×1041.7×1091.7×1056.4×1086.4×1041.7×1091.7×1052.0------------2.6------------4.0++++------------6.3++++34个菌+++++++++++6个菌+++++++++-++++--7.2*++++7个菌++++15个菌++++-++++3个菌----8.4++++×++++×++++×++++×++++×++++-×注：++++：无法计数；+++：无法计数，但散在单个菌落较多；++：菌落大都以单个散在形式存在，个别菌落粘连在一块；+：能够计数；×：未接种平板；*：10倍浓缩的PBS96小时pH4℃室温37℃O1O139O1O139O1O1396.4×1086.4×1041.7×1091.7×1056.4×1086.4×1041.7×1091.7×1056.4×1086.4×1041.7×1091.7×1054.0--×××××-××××6.3++++3个菌++++++++++1个菌++++++++++---7.2*+