酵母细胞固定化技术

酵母细胞固定化技术实验目的了解细胞固定化的原理和方法学习和掌握酵母细胞固定化的方法固定化细胞技术：用物理或者化学的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，并使其保持催化活性，可以反复使用的方法。应用：1、应用于食品、化学、医药、化学分析、环境保护、能源开发等。2、应用于生产各种胞外产物，包括酒精酒类，氨基酸，有机酸，酶，辅酶，抗生素，甾体转化，废水处理。3、用于制造微生物传感器。方法：①吸附法（载体结合法）原理：根据带点的微生物细胞和载体之间的静电，表面张力和粘附力的作用，使细胞固定在表面和内部优缺点：简便，活力损失小，但细胞和载体作用力小，易脱落定义：将酶（或细胞）吸附在载体表面上②包埋法：定义：将酶（或细胞）包埋在多孔的

水不溶性载体的紧密结构中，使其处于活化状体类型：a、凝胶包埋法b、半透明包埋法原理：a、将细胞包埋在各种凝胶内部的微控中而使细胞固定b、将细胞包埋在各种高分子聚合物制成的小球里优点：简单、条件温和、稳定性好、活性高，包埋细胞容量高，活力持久。（是最常用，最有效的方法）交联法：③定义：将酶（或细胞）相互连接起来（化学结合法）原理：利用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团发生反应，使其彼此交联形成网状结构的固定化细胞，其结合力是共价键。优缺点：制备麻烦，活力损失较大，但细胞与载体结合较紧④共价结合法原理：细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而使细胞固定。优缺点：结合紧密，不易脱落，但制备较难，且活力损失较大载体1、多糖类：纤维素，琼脂，葡萄糖凝胶，藻酸钙，K-角叉胶等2、蛋白质：骨胶原，明胶等3、无机载体：氧化铅，活性炭，陶瓷，磁铁，SiO2，磷酸钙凝胶等4、合成载体：聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，酚醛树脂5、多孔载体：海藻酸盐实验中以海藻酸盐，角叉胶和聚丙烯酰胺最为常用海藻酸盐优点：1、具有化学稳定性好2、无毒3、包埋效率高且价格低廉缺点：包埋时，凝胶颗粒容易破损，软化等，稳定性和机械强度较差，不利于固定化细胞的多次利用本次实验内容本次实验采用以海藻酸盐为例，运用包埋法介绍酵母细胞的固定化方法。实验材料与试剂菌种：酿酒酵母培养基：2%蔗糖培养基试剂：含10%葡萄糖溶液的0.05mol/LCaCI2溶液，海藻酸钠，无菌水器材：小烧杯，平皿，试管，无菌的锥形瓶，无菌吸管实验流程第一阶段：酵母细胞的活化第二阶段：细胞固定化第三阶段：固定化酵母的发酵第四阶段：酒精的检验酵母细胞的活化在缺水的状态下，微生物处于休眠状态，活化就是要让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态，酵母细胞所需要的活化时间较短，一般需要0.5-1h。细胞固定化1、称取海藻酸钠0.4g置于无菌烧杯中，加无菌水少许调成糊状，再加够10ml水，适当加热溶解。2、将溶好的海藻酸钠溶液冷却到45℃左右，加入预热至35℃左右的酵母细胞液，混合均匀，用无菌的吸管吸取混合液，逐滴加入预先盛有100ml含10%葡萄糖的0.05mol/LCaCI2溶液，使其成为凝胶珠，静置30min。3、待凝胶珠在溶解中浸泡30min后,用无菌水洗涤三次后加入2%蔗糖培养基中，置25℃下发酵7-9d，发酵结束后测定其酒精的含量。酒精的检测方法：用蒸馏法蒸馏出乙醇水容易，再用酒精计测量其究竟度数。注意事项加入海藻酸钠是操作中最重要的一环，涉及到实验的成败，浓度过高：难以形成凝胶珠；太低，形成的凝胶珠所包埋的酵母数量少，影响实验效果。刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下来方法：1、用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，看有没液体流出。2、用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弾起，表明制备的凝胶珠成功。实验结果及讨论观察凝胶珠的颜色和形状

①如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败。②如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，