蛋白质的测定使用凯氏定氮法解说

项目三

食品中蛋白质测定【学习目标】1、掌握食品中氮含量与蛋白质含量之间的换算。2、掌握凯氏定氮装置的搭建技术。3、掌握蛋白质的测定技术。【基础知识】1、蛋白质及氨基酸概述蛋白质由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物，它主要含的元素是C、H、O、N。一般来说，pro的平均含氮量为16/100，既一份氮相当于6.25份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。所以在用凯氏定氮法定量pro时，将测得的总氮%乘上pro的换算系数K=6.25即为该物质的pro含量。注意：①含N是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。②不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70、全小麦、大麦、燕麦、裸麦和小米是5.83；硬果类为5.30；牛乳及其制品为6.38。2、原理蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸胺。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。氨基酸～HCl～N〖注意〗此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗pro。3、适用范围国家标准第一法适用于各种食品中蛋白质的测定4、任务分解任务一：湿法消化任务二：碱法蒸馏硼酸吸收任务三：盐酸滴定任务四：数据记录与计算任务一：湿法消化子任务1：仪器及试剂的准备仪器：子任务1：仪器及试剂的准备试剂作用硫酸铜a催化作用：加速有机物的氧化分解。b消化完全的指示剂：蓝绿色，澄清，透明；c蒸馏时碱性反应的指示剂：变深蓝色或产生黑色沉淀硫酸钾提高溶液沸点，从而加快有机物分解浓硫酸氧化作用：有机物质氧化分解为H2O和CO2子任务2：样品预处理固体试样0.2~2g半固体试样2~5g液体试样10~25g样品充分混匀直接消化子任务3：样品称量、消化1.000g奶粉0.2g硫酸铜6g硫酸钾20mL浓硫酸玻璃珠小火加热炭化至泡沫完全停止轻摇大火加热保持瓶中液体微沸至蓝绿色澄清透明继续加热0.5～1h冷却加20mL水冷却同时做试剂空白试验思考1、玻璃珠的作用？2、小漏斗的作用？3、消化过程为什么要不断转动凯氏瓶？4、开始消化时为什么用小火？5、消化液不易澄清透明时可采用的措施？6、消化完成时的产物？7、加20mL水的作用？8、空白试验的目的？任务二：碱法蒸馏、硼酸吸收子任务1：仪器及试剂的准备仪器：10mL100mL3只子任务1：仪器及试剂的准备水蒸气发生器：装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数ml，使水呈微红色→按上图所示搭好装置〖注意〗①装置搭建好了之后要先进行捡漏，利用虹吸原理。②在蒸汽发生瓶中要加甲基橙指示剂数滴及硫酸数ml以使其始终保持酸性，以防水中氨蒸出。子任务1：仪器及试剂的准备试剂：40%氢氧化钠20%硼酸溶液混合指示剂1、1份甲基红乙醇溶液（1g/L）与5份溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）临用时混合酒红色→绿色2、2份甲基红乙醇溶液（1g/L）与1份亚甲基蓝乙醇溶液（1g/L）临用时混合紫红色→绿色子任务2：碱化蒸馏、硼酸吸收10.0mL硼酸溶液100mL三角瓶加1～2滴混合指示剂冷凝管下端插入三角瓶液面下准确吸取10mL试样由小玻杯流入反应室少量水洗涤小漏斗盖紧玻璃塞量筒取10.0mLNaOH溶液倒入小玻杯提起玻塞使其缓慢流入反应室立即塞紧玻璃塞加水于小玻杯防漏气通蒸汽颜色变化时开始计时蒸馏5min移动接受瓶使液面离开冷凝管下端再蒸馏1min用少量水冲洗冷凝管下端外部取下接收瓶

〖注意〗①加入NaOH一定要过量，判断NaOH是否过量的方法，看反应室内液体颜色加碱足量的判断：溶液会变成深蓝色或产生黑色沉淀原理：过量的氢氧化钠会跟硫酸铜反应生成氢氧化铜蓝色沉淀，蓝色沉淀在加热的情况下会分解成黑色的氧化铜沉淀。如果没有上述现象，说明氢氧化钠加的量不足，需要继续加入氢氧化纳，直到产生上述现象为止。②样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，为防止样液中氨气逸出。一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要水封，三要夹紧废液蝴蝶夹后再通蒸汽，四要在蒸馏过程中要注意接头处有无松漏现象③加热蒸馏出来的氨可以用硼酸进行吸收，因为硼酸只呈微弱酸性，不影响指示剂的变色反应，但是具有吸收氨的作用，与氨形成强碱弱酸盐。④冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。吸收液温度不应超过40℃，避免氨气逸出，若超过时可置于冷水浴中使用。⑤检验蒸馏是否完成的方法：奈氏试纸法。原理:NH4+或NH3遇奈氏试剂会反应生成综红色的碘化汞铵化合物，如NH4+或NH3含量较少，试纸呈黄色，若含量过多，呈棕黄色或棕红色的沉淀反应⑥在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断汽,否则会发生倒吸。⑦蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，再蒸1分钟，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。⑧所用的试剂溶液必须用无氨蒸馏水配制。任务三：盐酸滴定子任务1：仪器及试剂的准备仪器：25mL酸式滴定管1套试剂0.0500mol/LHCL标准溶液子任务2：盐酸滴定接收瓶以HCL标准滴定液滴定灰色终点记录VHcl（1）硼酸吸收液的颜色（2）吸收氨气后的硼酸吸收液的颜色（3）盐酸滴定终点的颜色〖注意〗①混合指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈红色。②酸式滴定管的正确使用项目名称检测日期样品名称检验依据内容123空白样品质量m/gV初/mLV终/

mL消耗的体积V1/mL吸取消化液体积V3/mL蛋白质含量（g/100g）平均值（g/100g）两次测定之差/平均值精密度Cy（g/100g）F：牛乳及其制品的蛋白质换算系数6.38任务四、数据记录与计算有效数字：蛋白质含量≥1g/100g时，结果保留三位有效数字蛋白质含量＜1g/100g时，结果保留两位有效数字。精密度：在重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%（g/100g）小结步骤反应前后颜色变化湿法消化凯氏烧瓶：样品无色（加硫酸前）→加硫酸炭化黑色→消化后红棕色→棕褐色→消化终点蓝绿色/墨绿色→淡蓝色（冷却后溶液）碱化蒸馏反应室：深蓝色或黑色沉淀硼酸吸收紫红色→绿色盐酸滴定甲基红和溴甲酚绿混合指示剂：绿色→灰色甲基红和亚甲基蓝混合液：绿色→蓝紫色凯氏定氮法用于所有动物、植物类食品的蛋白质含量的测定，但因样品中含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以测定结果为粗蛋白质含量。若要测定样品的蛋白氮,则需要向样品中加入三氯乙酸溶液,使其最终浓度为5%,然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸溶液后样品中的含氮量,进一步计算出蛋白质含量:

蛋白氮=总氮-非蛋白氮任务五：试验器具的清洗整理【拓展学习】1、其他蛋白质测定方法——分光光度法（1）原理食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。（2）特点快速、污染少、操作简单、省时

国家标准测定蛋白质第二法2、改良式凯氏装置江苏畜牧兽医职业技术学院泰州市质监局3、自动凯氏定氮法1.原理同常量凯氏定氮法2.主要仪器

自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置。消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红外加热装置组合成的消化炉。3、试剂

除硫酸铜与硫酸钾制成片剂外，其他试剂与常量测定相同。4、优点灵敏、准确、快速以及用量少准确称取某乳粉样品0.800克，