天然产物提取技术

天然产物的提取技术进入中试前的考虑：1.产率达到一定的稳定程度，质量可靠；2.工艺路线及操作步骤确定，建立和确定产品、中间体及原料的分析方法；3.确定和鉴定产品的生物材料的资源；天然产物提取中试设计进入中试前的考虑：3.确定和鉴定产品的生物材料的资源；4.物料的衡算，“三废”的处理方法；5.中试规模及原料的规格和数量；6.安全生产措施和方法。天然产物提取中试设计天然产物提取中试放大工艺特点：中试放大是由小试转入工业化生产的过渡性研究工作，对小试工艺能否成功地进入规模生产至关重要研究工作主要围绕着如何提高收率、改进操作、提高质量、形成生产等方面进行。一个工艺研究项目的最终目的是能在生产上采用。1.原辅材料规格的过渡试验；小试时：一般采用的原辅材料规格较高。

目的：是为了排除原料中所含杂质的不良影响，确保实验的准确性。大规模生产时：应改为生产时容易获得的原辅材料进行过渡性实验。转入中试放大生产的过渡性试验：2.设备选型与材料质量试验；小试阶段：大部分实验时在小型玻璃仪器中进行；中试阶段：要对设备材料的质量和设备的选型进行实验，为工业化生产提供数据。转入中试放大生产的过渡性试验：3.反应条件限度实验；目的:找到最适宜的工艺条件（如培养基种类、反应温度、压力、pH等），一般均匀一个许可范围。转入中试放大生产的过渡性试验：4.原辅材料、中间体及产品质量分析方法研究

中间体和新产品均无现成分析方法，须研究他们的鉴定方法，制定简便易行、准确可靠的检验方法。转入中试放大生产的过渡性试验：5.下游工艺研究

上游工艺：以生物材料资源生产为核心的研究内容；下游工艺：以产品的后处理为研究内容的操作。

必须研究尽量简化下游工艺操作，采用新工艺、新技术和新设备，提高劳动生产率，降低成本。转入中试放大生产的过渡性试验：中试放大的方法：

1.经验法：2.相似法：3.数学模型法中试放大的研究主要内容：1.工艺路线和各步反应方法的最后确定；2.设备材质和型号的选择；3.反应器的规模选择和反应搅拌器型式与搅拌速度的考察；4.生产反应条件的研究；5.工艺流程和操作方法的确定；中试放大的研究主要内容：6.物料衡算；7.安全生产与“三废”防治措施；8.原辅材料、中间体的物理性质和化工常数的测定；9.原辅材料、中间体质量标准的研究制定；10.消耗定额、原料成本、操作工时与生产周期等的计算。第二节原料细胞结构与提取工艺特性一、原料与天然产物提取工艺特性1.植物材料：根、茎、干果、花、叶等

根：如人参、丹参等用有机溶剂乙醇浸出；茎:可用有机溶剂加热浸出干果：可用有机溶剂浸出花：是由果胶类物质组成，需用酶或发酵的方法处理后再用溶剂提取；叶：多数不用处理，直接用溶剂提取；2.动物材料与天然产物提取工艺特性角类和骨类：加工前需要粉碎细一些；皮类：应用新鲜材料，加工前先破碎；3.海洋生物材料与天然产物提取工艺特性

海藻：抗肿瘤、防心血管疾病等；腔肠动物：海葵毒素；软体动物：抗病毒、抗肿瘤等；棘皮动物：海胆毒素；4.微生物与天然产物提取工艺特性

细菌放线菌蓝细菌真菌（霉菌和酵母菌）二、生物细胞的结构与天然成分的浸出

活性成分或有效成分存在细胞质中。

细胞有：细胞壁和细胞膜细胞有细胞壁和细胞膜；细胞膜类似于半透膜，具有超滤作用，即对细胞外的物质的透过有分子筛作用，筛孔有一定的大小，透过物质的分子较小时容易透过，较大的分子不易透过；活性成分/有效成分是存在细胞质中细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶物质组成，细胞壁上有许多小孔叫孔壁，不过，不影响水溶性物质的出入；对外界物质的进入或细胞内物质的外出有决定作用的是细胞膜。活性成分/有效成分是存在细胞质中植物原料外表面如叶、果实皮、茎皮等的表面组织上有蜡浸细胞壁，是蜡浸入细胞的纤维素壁中，形成蜡层。蜡层是由蜡醇和脂肪酸组成，使得细胞壁有很强的疏水性。有效成分的提取，要设法破坏一般细胞的细胞膜，改变细胞膜的通透性，使浸出溶剂进入细胞内，并把有效成分提取出来。对有蜡浸细胞壁组织表面的原料需破坏其蜡浸细胞壁，改变细胞壁的通透性。二、生物细胞的结构与天然成分的浸出

活性成分或有效成分存在细胞质中。

破坏细胞膜和细胞壁，

使有效成分提取出来。三、破坏细胞壁和细胞膜的方法1.风干法2.加热干燥法3.机械法4.非机械法5.化学法

在通风良好不见直射阳光的条件下开始时，由于外界空气的蒸汽压或相对湿度较低，细胞壁先失水，随后细胞质的液泡也失水，细胞液的浓度增高，使涨压减低萎蔫，终致细胞破坏到死亡。失水收缩，但不产生质壁分离，是机械伤害。改变膜的超滤性和渗透性，细胞内的物质易于被溶剂浸出。风干法，对有效成分损害小；1.风干法原料的细胞组织用风干法不易破坏的，且有效成分在加热时没有重大影响的条件下，可用加热法破坏原料组织结构；a.在浸出有效成分时，使细胞质和蛋白质凝集、变性、收缩，致使细胞膜和细胞壁破坏，提高渗透性，细胞内物质迅速向外扩散；2.加热干燥法b.新鲜原料切片后加热干燥，水分急剧蒸发，细胞内原生质和蛋白质凝固、变性、细胞萎缩，破坏细胞壁和细胞膜，改变细胞组织的渗透性；不适合热不稳定性物质；2.加热干燥法处理量大，速度快，但需采取冷却措施。a.球磨法:将细胞组织悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使细胞破碎；b.高压匀浆：利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击而造成细胞破裂；压力、温度和通过匀浆阀的次数；3.机械法：处理量大，速度快，但需采取冷却措施。c.X-press法：改进的高压方法；d.超声波法：在15－25KHz频率下操作，利用超声波的空穴作用，不适用于大规模操作；3.机械法：适于微生物的破碎，包括酶解、渗透压冲击、冻结和融化、热处理和化学法溶胞等；酶解：利用酶的反应分解破坏细胞壁上特殊的键，达到破坏目的，有专一性强，条件温和的优点；渗透压冲击：渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁破裂；适用于细胞壁较脆弱的菌；冻结和融化：在低温下突然冷冻和室温下融化，对此达到破坏细胞壁作用；适合细胞壁较弱的胞体；4.非机械法如：酸碱及表面活性剂处理；可以使蛋白质水解、细胞溶解或使某些组分从细胞内提取出来；脂溶性溶剂也可用于化学处理，如丁醇、丙酮、氯仿等；但这些溶剂常易引起生化物质破坏，同时还带来分离和回收化学物质的问题。5.化学法三、破坏细胞壁和细胞膜的方法选择合适的破碎方法，考虑下列因素：细胞的数量；所需要的产物对破碎条件的敏感性如：温度、化学试剂、酶等的敏感性；达到的破碎程度及破碎所需的速度等；尽可能采用温和的方法。1.形态与性状相结合的鉴别方法：按生物分类学形态鉴定的方法，依照各部分的形态，确定其所属分类学的科、属、种；再按其利用部位进行形态学与性状鉴定相结合的方法，做出鉴定结论。四、原料的质量控制2.显微粉末鉴定：在显微镜下观察其组织或细微的形态，做出鉴定结论；3.化学鉴别法：根据被鉴定原料的化学成分，利用TLC法或传统化学方法进行成分鉴定

四、原料的质量控制4.紫外光谱法：原料可用乙醇或甲醇浸出液在紫外光谱仪上测定紫外光谱；可靠、简单；四、原料的质量控制5.有效成分的含量测定：GC：分析和鉴定各成分，且同时确定定性和定量的结果，适用于芳香油、香豆素、脂肪酸等；四、原料的质量控制5.有效成分的含量测定：HPLC：分离效果更好的分析方法，比GC还要广泛，比TLC分离效果更好；需要仪器设备－高压液相色谱仪；紫外吸收光谱扫描；既可以定性分析，又可以定量分析且结果较为理想。四、原料的质量控制五、原料的前处理原料前处理的依据，要根据:原料组织的化学成分、有效成分的性质和生物化学的性质、原料的组织和细胞结构进行处理。1.除杂、洗涤、切割:需要在新鲜状态进行除杂和洗涤，原料处理按生产工艺的要求，选择采收原料的时间，制定除杂方法；五、原料的前处理2.原料的干燥：破坏细胞壁和细胞膜，利于浸出目的是为了便于贮藏和运输，有破坏细胞膜和细胞壁的作用，利于浸出的顺利进行；需采用不同的干燥方法进行干燥；

2.原料的干燥：例如：对热不稳定性的药材，多用风干法。中药材多用晒干法，在日光的直接照射下，干燥速度较快、细胞膜破坏较好，但不适合光不稳定性的有效成分的干燥；如：小檗根，含有双卞基异喹啉生物碱，对光不稳定，易发生结构改变，不适用于晒干法，适合风干法干燥。目的：增加原料的表面积，提高浸出速度。原料的粉碎程度同原料的种类和性质相关：草类原料，粉碎粗一些；木质类原料，粉碎细一些；较粗的根、茎和果实以及种子类原料，需粉碎的更细。3.粉碎：4.发酵和水解处理法：5.脱脂处理：原料中含较多的油、脂或蜡6.含挥发油类原料的处理：

宜在新鲜状态处理，防止成分改变；7.以酶和蛋白质为主要成分的原料处理：同6，需在新鲜状态处理，以免变性或失活。六、生理活性物质的保护措施对一些生物大分子如蛋白质、酶和核酸，主要的保护措施：1.缓冲系统：如磷酸盐溶液、柠檬酸溶液等；

目的是防止提取过程中某些酸碱基团的解离，造成活性物质的变性；2.加入保护剂：防止某些生理活性物质基团和酶的活性中心收到破坏。3.抑制水解酶的破坏4.其他一些特殊要求的保护第三节天然产物传统分离纯化方法提取法萃取法微波提取超声波提取过滤蒸发浓缩沉淀法结晶干燥一、提取法1.提取：（又称浸出、固液萃取）

是应用有机或无机溶剂将固体原料中的可溶性组分溶解，使其进入液相，再将不溶性固体和溶液分开的操作。溶质：提取原料的可溶性组分；溶剂：用于溶解溶质的液体，或称提取剂。一、提取法1.提取：（浸出、固液萃取）

溶剂提取法根据植物中各种有效成分在溶剂中的溶解作用，选用对有效成分溶解度大，对不需要成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从植物组织内提取出来。提取所得的含有溶质的溶液称为溢流液、浸出液或上清液；提取后的载体和残余的少量溶液称为残渣或提取渣。溶剂提取法根据植物中各种有效成分在溶剂中的溶解作用，选用对有效成分溶解度大，对不需要成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从植物组织内提取出来。一、提取法浸提是通过溶剂与原料接触，互相渗透、溶解以及扩散等一系列复杂过程而完成。由于植物原料的结构非常复杂，提取的物质又是多组分混合物，因此统一的浸提理论难以确定。一般包括：渗透、溶解、分配和扩散等

（1）渗透浸提开始时，渗透随被浸提植物原料的情况不同而异。如：对干原料，首先要湿润，一般新鲜的植物材料中水分占80%左右，原料与疏水性的石油醚溶剂接触时更为困难，为了加快渗透，需添加少量的极性溶剂如乙醇或丙酮等。（2）溶解

溶剂渗入细胞后，可溶解的成分按溶解度大小先后溶解到溶剂中去。对于干原料，以溶解过程为主。在细胞原生质中，溶剂和细胞液是分层的，精油在两相中都能溶解。若在两相中溶质浓度不平衡，则在相互接触时，将在相与相之间进行分配，即为有效成分从细胞液的液相转入溶剂相中，直到有效成分在细胞原生质液和溶剂两个液相内达到完全平衡。

（3）分配

K=C1/C2（在一定条件下）K－分配系数C1－两相平衡时被浸提组分在浸提液中的浓度C2－两相平衡时被浸提组分在被浸提混合物中的浓度溶剂的量比细胞原生质中液体的量要大得多，因此浸提比较完全。但是，这种分配现象对某些粉碎的植物原料的浸提可能就不是主要因素，而以溶解占主导作用。（4）扩散：从植物原料中浸提精油时，溶剂经渗透浸入含有精油的原料内，在细胞内生成一种溶液。根据分配原则，精油溶解到与之接触的溶剂中之后，引起溶剂中溶质浓度的上升；另一方面，溶剂本身将透入含高浓度溶质的细胞原生质溶液，浓度差称为扩散的动力，扩散作用一直进行到细胞内溶液成分的浓度和细胞外浸提液中成分的浓度达到相等时为止，即扩散浓度差等于零时为止。浸提过程只能更新溶剂，才能重新开始，直到新的浓度平衡时停止。（4）扩散：扩散系数公式：D=(RT/N)×(1/6πηr)

R－气体常数(8.31×107erg/度）

T－热力学温度

r－扩散粒子的半径

N－阿伏加德罗常数

η—扩散液内部的摩擦因数，即介质的黏度2.影响提取的因素溶剂浸提成功与否，关键在选择合适的溶剂和提取方法。原料的粉碎度提取时间、温度等也影响提取效率。样品粉碎越细，表面积越大，浸出过程快；但同样由于粉碎度过高，样品颗粒表面积过大，吸附增强，反而影响过滤速度。一般来说：水提取：可用粗粉（20目）或薄片有机溶剂提取：过60目为宜，全草、花类等以20-40目为宜。（1）粉碎度（2）提取温度：一般来说：冷提杂质少，效率低；热提杂质多，效率高；但温度不宜过高，加热在60℃左右为宜，最高不超过100℃。2.影响提取的因素（3）浓度差：溶剂进入细胞内，成分溶解后因细胞内外浓度差，就向外扩散，内外达到一定浓度时，扩散停止，即到了动态平衡，成分不再浸出；如果更新溶剂，又开始新的扩散，反复多次直至提取结束。加热回流提取法最好，最次为浸渍法（4）提取时间：一般来说：提取时间长，浸出量大；但时间过长，无用杂质增多；如用热水加热提取：每次0.5h-1h为宜，最多不超过3h；乙醇回流：每次1h-2h为宜；其他试剂可适当增长3.浸出溶剂的选择植物成分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。溶剂可分为水、亲水性有机溶剂和亲脂性有机溶剂。一些常见溶剂的亲脂性的强弱顺序如下：石油醚>苯>氯仿>乙酸乙酯>丙酮>乙醇>甲醇>水一些常见溶剂的亲水性的强弱顺序如下：石油醚<苯<氯仿<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇<水3.浸出溶剂的选择溶剂选择的三个原则：浸出速度快；浸出物的纯度高、杂质少、质量好；成本低3.浸出溶剂的选择提取活性成分时，可选择单一溶剂或几种不同极性的溶剂进行分布提取，将各成分依此提取出来。一般先采用极性低的亲脂性溶剂进行提取，往往先将植物加适量水湿润，晾干后提取。再用能与水相溶的有机溶剂如丙酮、乙醇和甲醇等，最后用水提取。4.提取设备固液萃取主要包括：不溶性固体中所含的溶质在溶剂中溶解的过程；分离残渣与提取液的过程；在后一个过程中，不溶性固体与提取液往往不能分离完全。4.提取设备操作方式：间歇式、半连接式、连接式固体原料处理方式：固定床、移动床和分散接触式溶剂和固体原料接触的方式：多级接触和微分接触。选择设备:固体原料的形状、颗粒的大小、物理性质、处理难易及所需的费用等。溶剂提取方法浸渍法渗漉法煎煮法回流法连续回流提取法连续回流提取法二、萃取法（液-液萃取）1.原理：

两相溶剂提取称为萃取法，是利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中的分配系数的不同进行分离的方法。萃取时，各成分在两相溶剂中分配系数相差越大则分离效率越高，可用于从溶液中提取、分离、浓缩有效成分或除去杂质。萃取法的操作温度低，适于对热不稳定成分的分离；如：水为浓缩液，可用水不相容的溶剂，石油醚、苯、氯仿、乙酸乙酯等KD=分配系数：在定温定压下，如果一个溶质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里，达到平衡后，设溶质在两相中浓度的比等于为一常数在萃余相中的浓度在萃取相中的浓度萃取相一般为水相；萃取相一般为有机相萃取法（液-液萃取）利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。萃取时如果各成分的分配系数相差越大，分离效率越高萃取法（液-液萃取）提取液中的有效成分是亲脂性的物质，一般多用亲脂性有机溶剂，如苯、氯仿或乙醚进行两相萃取；有效成分是偏于亲水性的物质，需用弱亲脂性的溶剂，例如乙酸乙酯、丁醇等。提取黄酮类成分多用乙酸乙脂和水的两相萃取。提取亲水性强的皂甙则多选用正丁醇、异戊醇和水作两相萃取。三、微波提取法微波提取（microwaveassistedextraction)利用微波能进行物质萃取的一种新技术；已经涉及到几大天然化合物（挥发油、苷类、多糖、萜类、生物碱、甾体）微波提取的原理和特点1.介于300MHz-30GHz（波长在1cm-1m，介于红外和无线电波之间）之间的电磁波2.提取过程中，微波加热导致植物细胞内的极性物质吸收微波能，产生热量，破坏细胞膜和细胞壁。使得胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放出细胞内产物。3.当样品与溶剂混合并被微波辐射时，溶剂短时间内即被加热至沸点，由于沸腾在密闭容器中发生，温度高于溶剂常压沸点，而且溶剂内外层都达到这一温度，促使成分很快被提取。4.优点：投资少、设备简单、有效成分得率高、溶剂耗量少，无污染等；5.缺点：设备的一次性投资较大，运行成本高，且难于萃取强极性和大分子量的物质。2.微波提取的装置和条件装置包括：微波炉装置和提取容器（实验室：商业化的家用微波炉）提取效益：微波提取频率、功率和时间实例1微波提取重楼皂苷与水浴加热回流对比表明：微波并未破坏药物的结构时间、次数、含量实例2微波提取红景天苷与乙醇加热回流对比微波处理1.5min，水提10min得到；70%乙醇回流提取2h得到物质；提取率一致的条件微波提取的优点质量大都相当或优于溶剂回流、超临界二氧化碳提取等；操作方便装置简单提取时间短、提取率高溶剂用量少产品纯正等四、超声波提取法超声波：指频率高于20KHz，人的听觉耳阈以外的声波。

Ch.P（2000）应用超声波处理的由232品种；Ch.P（1995）应用超声波处理的有117种；超声波提取：利用超声波具有的机械效应、空化效应及热效应，通过增大介质分子的运动速度、增大介质的穿透力以提取生物有效分成的方法。1.提取原理（1）机械效应：超声波在介质中的传播可以使介质质点在其传播空间内产生振动，从而强化介质的扩散、传质。a.辐射压强对物料有很强的破坏作用，使细胞组织变形、植物蛋白质变性；b.促使产生摩擦力，使生物分子解聚，使细胞壁上的有效成分更快地溶解于溶剂中(2)空化效应通常情况下，介质内部或多或少地溶解了一些微气泡，这些气泡在超声波的作用下产生振动，当声压达到一定值时，气泡由于定向扩散而增大，形成共振腔，然后突然闭合，这就为超声波的空化效应。(2)空化效应增大的气泡在闭合时，产生的高压，形成微激波，可造成植物细胞壁及整个生物体破裂，且在瞬间完成，利于有效成分的溶出。(3)热效应在介质传播中，其声能不断被介质的质点吸收，介质将所吸收能量的全部或大部分转变成热能，从而导致介质本身和药材组织温度的升高，增大药物有效成分的溶解度，加快有效成分的溶解速度。(3)热效应由于内部温度的升高是在瞬间完成，可以使被提取成分的结构和生物活性保持不变。2.超声波的特点不需加热，适用于对热敏物质的提取，节省能源；提高了有效成分的提取率，节省了原料药材，利于资源保护；溶剂用量少，节约溶剂；是一个物理过程，不影响有效成分的生理活性有效成分含量高，利于进一步精制。3.影响超声波提取的因素时间影响：比常规提取的时间短，一般在10min-100min以内，较好效果

超声波频率：是主要的影响因素；3.影响超声波提取的因素温度影响：水一般最佳温度为60℃，有机溶剂需实验筛选；

超声波的凝聚机制：可提高提取率，缩短时间；4.超声波提取对中药有效成分性质的影响超声波提取具有省时、节能、提取率高的特点；对有机小分子的提取不会破坏分子结构；但对生物大分子，如多肽、蛋白质或酶的提取中，可能会破坏其结构，进而影响其生理活性。五、结晶天然产物化学成分在常温下，多半是固体物质，都具有结晶化的通性；可以根据溶解度的不同用结晶达到分离精制成为单体纯品。五、结晶纯化合物的结晶有一定的熔点和结晶学的特征，有利于鉴定。求得结晶并制备成单体纯品，是鉴定天然产物成分、天然产物提取生产的重要步骤。结晶是物质从液态或气态形成晶体的过程，绝大多数物质的结晶是从液态通过一定条件形成晶态。五、结晶晶体具有一定的几何外形，离子、原子或分子在组成晶体时都形成有规则的排列；生成结晶的过程叫结晶生长。从比较不纯的结晶，再通过结晶作用精制得到较纯的结晶，这一过程叫再结晶。1.结晶的方法在工业上，结晶的方法原理上常分为两大类第一类

除去一部分溶剂，如蒸发浓缩使溶液产生过饱和状态而析出结晶；第二类不除去溶剂，而用直接加入沉淀剂及降低温度等方法，使溶液达到饱和状态而析出。第二类不除去溶剂，而用直接加入沉淀剂及降低温度等方法，使溶液达到饱和状态而析出。大致可分为：a.盐析法：用于大分子蛋白质、酶等；b.有机溶剂结晶法：小分子氨基酸等；c.等电点结晶法：多用于两性物质；d.其他：温差法，加入金属离子法等。盐析法：a.加固体盐法(以细胞色素C为例）加正丁醇浓缩树脂洗脱细胞色素C1.加入硫酸铵（0.43g/1g)2.硫酸铵溶解称量1.加抗坏血栓（5mg/1g)，

36％氨水冷至10℃加少量硫酸铵至溶液微浑浊

塞好塞子放置1-2d(15-25℃)结晶

加硫酸铵（0.02g/ml)结晶完全盐析法：b.加饱和盐溶液(牛胰凝乳蛋白酶重结晶为例）溶解在0.01mol/L硫酸中5g粗结晶加入饱和硫酸铵

5ml加100g/LNaCl5mL,5min加完

过滤放置2d(室温)结晶完全结晶完全放置1h(20℃)溶菌酶溶在0.04mol/L醋酸缓冲液

5mL,pH4.7溶于0.4mol/L硼砂中

pH9粗品7d过滤滤液加入结晶透析液透析透析3-4dc.透析法(以羊胰蛋白酶为例）结晶结晶完全盐析法：有机溶剂法：a.丙氨酸结晶为例低层析纯的丙氨酸