枇杷叶内生菌菌种内细菌的分离培养与鉴定(终)

枇杷叶内生菌菌种内细菌的分离培养与鉴定［摘要］目的：对3种不同来源的枇杷叶中内生菌进行培养与鉴定。方法：将枇杷叶削除表皮，研钵研碎后获得组织提取液，用稀释法对叶内生菌中的细菌进行培养，最后单染色法对细菌进行染色，用显微观察法对细菌进行观察。结果：培养皿中菌落形态各自呈现出不同特征。结论：枇杷叶内生菌中不同细菌的种群、数量存在显著差异。［关键字］枇杷内生菌多样性1引言：枇杷：属蔷薇科枇杷属植物，其花、果、叶和根均可入药，具有清肺，降气化痰的功效。果实风味甘酸、性凉，具有清肺、润肺、宁嗽、止咳、合胃、止渴、下气、止吐逆、主上焦热和润五肺之功效。国内已开发出强力枇杷露等多种枇杷制剂，因枇杷具有多种功效，广泛应用于临床用药。因此，我们对枇杷内生细菌进行了培养、菌株分离等初步研究。2实验部分：2.1材料新鲜翠绿枇杷叶数片(采自浙江理工大学下沙校区百草园4棵不同枇杷树上)。原植物经鉴定为枇杷牛肉膏蛋白胨固体培养基(用于培养)、牛肉膏蛋白胨固体培养基+制霉菌素(用于筛选细菌)。2.2操作方法：2.2.1内生细菌的分离：用自来水将新鲜植物表面洗净，于1000ml95%酒精中浸泡3-5min，后无菌水冲洗3-4次，至于超净台备用。用研钵将枇杷叶碾碎，加入适量无菌水，后用1ml移液器吸取原液10ml于空带盖试管中，标号①。用稀释法分别将原液稀释成10人-1〜10人-5倍于已装有9ml无菌水试管中配成10ml溶液，分别标号②〜⑥，获得梯度样液，至于超净台中备用。在超净台中将上述6管样液用200ul移液器各移取200ul至已倒好的6个平板中，酒精灯旁分别涂布，对应编号，标记稀释倍数、日期、组别，于26^培养箱中倒置培养3〜5天。2.2.2内生细菌的鉴定：对培养皿中分离所得的细菌分别挑取5个菌斑，采用单染色法分别对菌斑染色，后对染色后的细菌进行显微形态特征的观察、鉴定。2.3操作过程：2.3.1制样液在超净台上，用研钵将早期置于其中的枇杷叶研碎,用无菌水溶解，纱布过滤，得到样液备用。用1ml移液器从装有样液的烧杯中吸取1mL注入已装有9mL无菌水的试管中，充分混匀,编号②。后用1ml移液器从②号试管中吸取1mL样液注入另一装有9mL无菌水的试管中,编号②。以此类推分别制成10人-3〜10人-5倍稀释度的各种样液，分别编号③〜⑥。2.3.2涂布平板法分离微生物⑴倒平板:将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基冷却至55-60OC时,向其中加入制霉菌素0.6mL(50ug/mL),倒平板.方法:右手持盛有培养基的锥形瓶，置火焰旁5cm〜10cm内，左手用手掌边缘和小指控制培养皿,锥形瓶口在火焰上灭菌,后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15mL,加盖后平置于台面上,待冷凝后即成平板.(2)涂布:将培养基分别用记号笔写上1〜10人-56种稀释度，后用200ul移液器分别从10人-1,10人-2,10人-3,10人-4,10人-5的稀释液中取200uL对号放入已写好稀释度的平板中,后再吸取原液0.2ml于编号1倍的培养基中。用无菌玻璃涂布棒在培养基表面轻轻地涂布均匀.⑶培养:将牛肉膏蛋白胨平板于26OC培养箱中倒置培养3~5日.2.3.3观察:几天后进行观察记录，并将分离所得的细菌用单染色法染色后镜检.细菌的单染色法：1、 涂片：取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作分别挑取培养所得细菌于载玻片的生理盐水中涂抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜(每一种菌制一片)2、 干燥：于室温中自然干燥。3、 固定：涂片面向上，于火焰上通过2—3次，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。4、 染色：水平放置玻片，滴加染色液于涂片薄膜上，番红染色液染色1—2分钟。5、 水洗：倾去染液，自来水冲洗。用吸水纸吸取多余水分，自然干燥。2.4 结果观察：2.4.13天后：5个培养基中，编号10A-1培养基中长有单菌落，菌落呈现出小，黄色,湿润,圆形，隆起,不透明，边缘整齐等特点，而其余培养基均无菌生成；1星期后：5个培养基中，编号10八-1培养基中长有单菌落，呈现出大，黄色，湿润，圆形，隆起,不透明，边缘整齐等特点，而其余培养基均无菌生成；2星期后：5个培养基中，编号10人-1,10人-2培养基中长有单菌落。10人-1培养基中长有许多单菌落，其中的单菌落呈现出单个分散，小而均匀，个别微大，颜色有黄色和白色，湿润，部分菌落有隆起,边缘整齐且不透明等特点；10人-2培养基中长有许多单菌落，其中的菌落呈现出单个分散，小而均匀，颜色为粉色，湿润，扁平，半透明，边缘整齐，有个别边缘不整齐等特点。而其余3个培养基仍没有菌生成.对染色后细菌镜检观察后，我们发现细菌均呈现出不同特点，细菌种群、数量存在显著差异。结果观察与讨论:结果观察:

3天后5个培养基中，除10、倍稀释度的培养基中长有菌落外，其余培养基均没有菌生成。10”-1倍稀释度培养基:只生成一个菌落很小，黄色，湿润，圆形，隆起，不透明，边缘整齐。1星期后5个培养基中，除10”-1倍稀释度的培养基中长有菌落外,其余培养基均没有菌生成。10”-1倍稀释度培养基:只生成一个菌落大，黄色，湿润，圆形，隆起，不透明，边缘整齐。2星期后5个培养基中，10”-1,10”-2倍稀释度的培养基中长有菌落，其余3个培养基仍没有菌生成。

10=倍稀释度培养基:长有很多菌落单个分散，小而均匀，个别微大，颜色有黄色和白色，湿润，部分菌落有隆起，边缘整齐且不透明。10、倍培养基:长有很多菌落单个分散，小而均匀，颜色为粉色，湿润，扁平，半透明，边缘整齐,有个别边缘不整齐。菌落编号辨别要点菌落描述辨别结果湿十表面边缘隆起形状颜色水溶性色素透明度厚薄大小松密大小正面反面1薄梢大扁平整齐\粉色淡粉半透细菌2薄梢大扁平整齐\粉色淡粉半透细菌3薄小扁平整齐\粉色淡粉半透细菌4薄大扁平整齐\粉色淡粉半透细菌5薄大扁平整齐\粉色淡粉半透细菌6薄稍小扁平整齐\粉色淡粉半透细菌7薄大扁平整齐\白色黄色半透细菌8厚很大^起整齐圆黄色黄色不透细菌9薄梢大扁平整齐椭圆白色黄色不透细菌10薄（半湿润）大扁平整齐圆白色黄色不透细菌总结与展望:蒸汽灭菌后应迅速进行倒平板操作，目的是为了防止培养基凝固。涂布分离应在培养基完全凝固后进行，不可过早，否则操作时容易将培养基弄破分装时培养基液不能超过锥形瓶的1/2，目的是为了防止高温蒸汽灭菌时溢出本次实验最终只有稀释倍数为10人-1的培养基上生长有菌落，分析其原因可能有以下几点：实验操作时，枇杷叶在酒精中浸泡时间太长，大部分菌被杀死在配置