标准解读

《NY/T 679-2003 猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法》是一项农业行业标准，主要针对猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）的检测提供了一种基于免疫酶技术的方法。该标准详细规定了从样本采集、处理到最终结果判断的整个实验流程。

标准中首先明确了适用范围，指出此方法适用于猪繁殖与呼吸综合症病毒抗体的定性检测。接着，对所需的主要试剂和材料进行了列举，包括但不限于特异性抗原、酶标记二抗、底物溶液等，并强调所有试剂需按照说明书或实验室验证条件正确使用。

在样品准备部分，标准指出了血清样本的收集方式及保存要求，确保样本质量符合后续分析需求。对于具体的操作步骤，则是从包被板的选择开始介绍，通过一系列固定化抗原、封闭非特异位点、加入待测血清稀释液、洗涤去除未结合成分、添加酶标二抗、再次洗涤后显色反应直至终止反应的过程来完成。

此外，还提供了如何设置对照组以及阳性、阴性对照的具体指导，以保证每次实验的有效性和可重复性。关于结果判读，标准给出了明确的标准曲线制作方法及临界值确定原则，帮助实验人员准确区分阳性与阴性样本。

最后，文档也提及了一些注意事项，比如实验过程中应严格遵守无菌操作规程，避免交叉污染；同时提醒使用者注意个人防护措施，防止生物安全事故发生。


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  • 现行
  • 正在执行有效
  • 2003-07-30 颁布
  • 2003-10-01 实施
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文档简介

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中华人民共和国农业行业标准

犖犢／犜６７９—２００３

猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法

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２００３０７３０发布２００３１００１实施

中华人民共和国农业部发布

书

犖犢／犜６７９—２００３

前言

本标准的附录Ａ为规范性附录。

本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口。

本标准起草单位：农业部兽医诊断中心。

本标准主要起草人：王宏伟、王传彬、陈西钊、田克恭。

Ⅰ

书

犖犢／犜６７９—２００３

猪繁殖与呼吸综合症免疫酶试验方法

１范围

本标准规定了猪繁殖与呼吸综合症（ＰＲＲＳ）免疫酶试验和免疫酶组织化学方法。

本标准适用于检测猪血清中的猪繁殖与呼吸综合症病毒（ＰＲＲＳＶ）抗体和组织中的ＰＲＲＳＶ抗原。

２免疫酶试验

２．１材料准备

２．１．１试剂

２．１．１．１磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）：配制见第Ａ．１章。

２．１．１．２抗原涂片的制备：ＰＲＲＳＶ接种于生长至７０％～８０％单层的Ｍａｒｃ１４５细胞。接种后３ｄ～

４ｄ，病变达５０％～７５％时，用胰蛋白酶消化分散感染的细胞单层，ＰＢＳ洗涤三次后，稀释至１×１０６个细

胞／ｍＬ。取印有１０个～４０个小孔的室玻片，每孔滴加１０μＬ。室温自然干燥后，冷丙酮（４℃）固定

１０ｍｉｎ。密封包装，置－２０℃备用。

２．１．１．３标准阳性血清：ＰＲＲＳＶ试验感染猪制备的血清。

２．１．１．４标准阴性血清：无ＰＲＲＳＶ感染、未经免疫的猪血清。

２．１．１．５酶结合物：辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的葡萄球菌Ａ蛋白（ＳＰＡ）。

２．１．１．６底物溶液：配制见第Ａ．２章。

２．１．２器材

ａ）普通光学显微镜；

ｂ）印有１０个～４０个小孔的室玻片；

ｃ）微量加样器，容量５μＬ～５０μＬ；

ｄ）３７℃恒温培养箱或水浴箱。

２．１．３样品

采集被检猪血液，分离血清。血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，４℃或－３０℃

保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用ＰＢＳ作１０倍稀释。

２．２操作方法

２．２．１取出抗原涂片，室温干燥后，滴加１０倍稀释的待检血清和标准阴性血清、标准阳性血清，每份血

清加两个病毒细胞孔和一个正常细胞孔，置湿盒内，３７℃３０ｍｉｎ。

２．２．２ＰＢＳ漂洗三次，每次５ｍｉｎ，室温干燥。

２．２．３滴加适当稀释的酶结合物，置湿盒内，３７℃３０ｍｉｎ。

２．２．４ＰＢＳ漂洗三次，每次５ｍｉｎ。

２．２．５将室玻片放入底物溶液中，室温下显色５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ。ＰＢＳ漂洗两次，再用蒸馏水漂洗—次。

２．２．６吹干后，在普通光学显微镜下观察，判定结果。

２．３结果判定

２．３．１在阴性血清对照、阳性血清对照成立的情况下：即阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均

无色；阳性血清与正常细胞反应无色，与病毒感染细胞反应呈棕黄色至棕褐色，即可判定结果；否则应

重试。

２．３．２待检血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均呈无色，即可判为

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