第三章荧光分析法

第三章荧光分析法2/6/20231目录§3-1概述§3-2荧光分析基本原理§3-3荧光分析仪器

§3-4荧光分析方法及应用2/6/20232§3-1概述分子发光

某些物质的分子吸收一定能量跃迁到较高的电子激发态后，在返回电子基态的过程中伴随有光辐射的现象。光致发光

物质因吸收光能而激发发光的现象。荧光

当紫外光照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外线停止照射时，所发射的光线也随之很快地消失，这种光线——荧光。2/6/20233发展史理论：第一次记录荧光现象：1575年，西班牙内科医生、植物学家莫纳德斯(N.Monardes)提到：一种木头切片的水溶液呈“可爱的天蓝色”。17世纪，波义尔(Boyle)和牛顿(Newton)等再次观察到荧光现象并给予了更详细的描述。1852年，斯托克斯(G.G.Stokes)用分光光度计考察奎宁和叶绿素时发现：λ吸<λ荧（斯托克斯定则），所以判断荧光是先吸光再发光，即荧光是发射光。并且根据发荧光的矿物“萤石”→荧光。此外他还研究了荧光强度与浓度之间的关系；描述了高浓度时及有外来物质存在时的荧光猝灭现象。他也是第一个提出应用荧光作分析手段的人。2/6/202341867年，瑞士，高贝尔斯莱德(F.Goppelsröder)进行了首次的荧光分析工作，应用铝-桑色素配合物的荧光进行铝的测定。1880年，莱伯曼(Liebeman)提出了最早关于荧光与化学结构关系的经验法则。19世纪末，人们已经知道了600种以上的荧光化合物。

20世纪以来，荧光现象的研究就更多了：1905年，伍德(Wood)发现共振荧光。1914年，弗兰克(Frank)和赫兹(Hertz)利用电子冲击发光进行定量研究。1922年，Wawillous

进行荧光产率的绝对测定。1926年，盖维奥拉(Gaviola)进行了荧光寿命的直接测定。……2/6/20235仪器：19世纪前，荧光观察靠肉眼。1928年，哲蒂(Jette)和维斯特(West)研制出第一台光电荧光计。如今，已有各式各样新型的荧光分析仪问世。荧光分析已成为一种十分重要且有效的光谱分析手段2/6/20236§3-2荧光分析基本原理一、荧光和磷光的产生发光

室温下，大多数分子处在基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)后被激发，跃迁到激发态，激发态不稳定，分子将很快衰变到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象称为“发光”。2/6/20237

◆

原理：1.分子能级每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级，而每个电子能级中又包含一系列的振动能层和转动能层。

So：基态

S1:第一电子激发单重态

S2:第二电子激发单重态

T1:第一电子激发三重态

T2:第二电子激发三重态

ν=0,1,2,3…振动能层图3.1荧光和磷光体系能级图2/6/202382.电子激发多重度M

s:电子自旋量子数代数和，数值为0或1。单重态分子轨道中的电子都是自旋配对的,自旋方向相反.s=0，M=1用符号S表示三重态电子跃迁过程中伴有自旋方向的改变s=1，M=3用符号T表示2/6/202393.分子去活化处在激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁等去活化过程返回基态，其中以速度最快、激发态寿命最短的途径占优势。有以下几种基本的去活化过程。振动驰豫内转换荧光发射系间跨越磷光发射外转换图3.1荧光和磷光体系能级图2/6/202310振动驰豫当分子吸收光辐射后可能从基态的最低振动能层S0(ν=0)跃迁到激发态Sn(ν=i)的较高的振动能层上去。然而在液相或压力足够高的气相中，分子间碰撞的几率很大，激发态分子可能将过剩的振动能量以热的形式传递给周围的分子，而自身从Sn或Tn的高振动能层(ν=i)失活到该电子能级的最低振动能层(ν=0)上，这一过程称为振动弛豫（振动松弛）。时间10-12sSn或Tn的νi→

ν0

，即各振动能级间的小箭头。2/6/202311图3.1荧光和磷光体系能级图2/6/202312内转换相同多重度等能态间的一种无辐射跃迁过程称为内转换。当两个相同多重度电子能级的振动能层间有重叠时，则可能发生电子由高能层电子激发态以无辐射跃迁方式跃迁到低能层的电子激发态。如由S2→S1

，T2→T1。时间10-13-10-11s分子最初无论在哪一个激发单重态，都能通过振动弛豫和内转换到达最低激发单重态(或三重态)的最低振动能层上。2/6/202313图3.1荧光和磷光体系能级图2/6/202314荧光发射当分子处于单重激发态的最低振动能级S1(ν=0)时，发射一个光子返回基态S0(ν=i)，这一过程称为荧光发射。由于溶液中振动弛豫效率很高，它在荧光发射之前和发射之后都可能发生。因此发射荧光的能量比分子所吸收的能量要小，即荧光的特征波长比它所吸收的特征波长要长。时间10-9-10-7s荧光多为S1→

S0

跃迁。2/6/202315图3.1荧光和磷光体系能级图2/6/202316系间跨越不同多重度状态间的一种无辐射跃迁过程称为系间跨越。它涉及受激电子自旋状态的改变。如S1→T1，使原来两个自旋配对的电子不再配对，这种跃迁一般是禁阻的。但如果两个不同多重度电子能态的振动能层有较大的重叠时则可能通过自旋—轨道耦合等作用使其实现。2/6/202317图3.1荧光和磷光体系能级图2/6/202318磷光发射当从单重态到三重态的分子系间跨越跃迁发生后，接着发生快速的振动弛豫而到达三重态的最低振动能层上，当没有其他过程同它竞争时，分子将发生磷光跃迁回基态，这一过程称为磷光发射。荧光与磷光的根本区别是：荧光：由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层的跃迁产生。磷光：由激发三重态最低振动能层至基态各振动能层的跃迁产生的。

E荧>E磷，λ荧<λ磷时间10-4-10s2/6/202319图3.1荧光和磷光体系能级图2/6/202320外转换激发分子通过与溶剂或其他溶质分子间的相互作用和能量转换，使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程称外转换。这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。由较低的激发单重态及较低的三重态的非辐射跃迁可包含外转换，也可包含内转换。2/6/202321二、激发光谱和发射光谱

任何荧光(磷光)化合物都具有两个特征光谱：激发光谱和发射光谱。它们是荧光(磷光)定性和定量分析的基本参数和依据。激发光谱选择：荧光和磷光都是光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，这可从它们的激发光谱曲线来确定。绘制：固定测量波长（选荧光/磷光的最大发射波长），改变激发光的波长，测量荧光强度的变化，以激发光波长为横坐标、荧光强度为纵坐标作图，即得到荧光(磷光)化合物的激发光谱。2/6/202322激发光谱的形状与吸收光谱的形状极为相似，经校正后的真实激发光谱与吸收光谱不仅形状相同，而且波长位置也一样。这是因为物质分子吸收能量的过程就是激发过程。发射光谱：荧(磷)光光谱绘制：将激发光波长固定在最大激发波长处，然后扫描发射波长，测定不同发射波长处的荧(磷)光强度，即得到荧(磷)光发射光谱。例：图3.2为萘的激发光谱、荧光发射光谱和磷光发射光谱。荧光发射光谱显示了若干普遍的特性：2/6/202323Stokes位移在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去振动能，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此在激发和发射之间产生了能量损失。图3.2萘的激发光谱I、荧光II和磷光光谱III激发/吸收光谱磷光光谱荧光光谱2/6/202324荧光发射光谱的形状与激发波长无关。这是因为分子吸收了不同能量的光子可以由基态激发到几个不同的电子激发态，而具有几个吸收带。由于较高激发态通过内转换及振动弛豫回到第一电子激发态的速率是很高的，远大于由高能激发态直接发射光子的速率。故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光激发，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能层，所以荧光发射光谱与激发波长无关。2/6/202325图3.1荧光和磷光体系能级图2/6/202326镜像规则

荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。吸收光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能层所致。其形状决定于第一电子激发态中各振动能层的分布情况。荧光光谱是激发分子从第一电子激发态的最低振动能层回到基态中各不同能层所致。所以荧光光谱的形状决定于基态中各振动能层的分布情况。基态中振动能层的分布和第一电子激发态中振动能层的分布的情况是类似的，因此荧光光谱的形状和吸收光谱极为相似。2/6/202327图3.3蒽的乙醇溶液的荧光光谱（右）和吸收光谱（左）ν=014321432ν=0S1S02/6/202328休息！2/6/202329三、荧光和分子结构的关系

分子产生荧光必须具备两个条件：

(i)分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光。

(ii)吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率。思考：什么样结构的物质会发生荧光？化学结构上的改变对物质荧光强度和荧光光谱有什么样的影响？2/6/202330荧光量子产率:它表示物质发荧光的能力许多吸光物质并不能发荧光，因为在激发态分子释放激发能的过程中除荧光发射外，还有许多上面提到的辐射和非辐射的跃迁过程与之竞争。荧光的量子产率与上述的每个过程的速率常数有关。表达式如下荧光发射过程的速率常数

其他有关的过程速率常数总和凡是可以使升高，降低的因素都可以增强荧光主要决定于化学结构，主要决定于化学环境，也与化学结构有关。2/6/202331跃迁类型实验表明，大多数荧光化合物都是由π→π＊或ｎ→π＊跃迁激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生π＊→π或π＊→ｎ跃迁而产生荧光，其中π＊→π的跃迁的量子效率较高。此外，在π＊→π

跃迁过程中，通过系间跨越跃迁至三重态的速率常数也较小，也有利于荧光的发射。共轭效应含有π→π＊跃迁能级的芳香族化合物的荧光最强。这种体系中的π电子共轭度越大，则π电子非定域性越大，越易被激发，荧光也就越易发生，而且荧光光谱将随共轭程度的增加向长波移动。绝大多数能发生荧光的物质含有芳香环或杂环。任何有利于提高π电子共轭度的结构改变都将提高荧光效率，并使荧光波长向长波方向移动。2/6/202332刚性平面结构实验发现多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其他溶质分子的相互作用减小，减少了碰撞去活的可能性。酚酞荧光素无荧光强荧光氧桥2/6/202333取代基效应芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。给电子基团，如-0H、-OR、-NH2、-CN、-NR2等，使荧光增强。吸电子基团，如-COOH、-C=O、-NO2、-NO、卤素离子等，会减弱甚至猝灭荧光。如果将一个高原子序数的原子引入到π电子体系中，往往会增强磷光而减弱荧光。“重原子效应”——增加系间跨越速率所致。2/6/202334如，卤代苯中双取代和多取代物对非定域π电子激发的影响较难预测。但若能增加分子的平面性，例如取代基之间能形成氢键，则荧光增强；反之，则荧光减弱。溴苯无荧光氟苯氯苯碘苯2/6/202335四、溶液的荧(磷)光强度荧光强度与溶液浓度的关系荧光量子产率荧光强度If与溶液浓度c的关系：根据Beer定律，经推导可得：当I0和

一定时：吸收的光量

线性关系成立条件2/6/202336影响荧光强度的因素溶剂：溶剂效应和特殊溶剂效应。溶剂效应：溶剂的折射率和介电常数的影响。普遍存在。溶剂对光的散射和折射。溶剂极性增大，对激发态的稳定作用增强，使荧光强度增加，光谱红移。特殊溶剂效应：荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用。如氢键的生成和化合作用。对荧光光谱的强度和形状影响大。温度：敏感，影响大。下降：碰撞失活几率减小，有利于荧光产生。分析时要控制好温度。———（？）2/6/202337溶液pH值：带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光一般都与溶液的pH有关。影响分子的存在形式。如，苯胺：pH7-12，分子形式，蓝色荧光

pH<2或pH>13，离子形式，无荧光金属离子与有机试剂形成的发光螯合物也受到溶液pH的影响。影响螯合物的形成和组成。如，镓与2,2’-二羟基偶氮苯的螯合物：

pH3-4，1:1螯合物，有荧光

pH6-7，1:2螯合物，无荧光2/6/202338内滤光作用和自吸收现象：内滤光作用：溶液中若存在着能吸收激发或荧光物质所发射光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为内滤光作用。

如：1μg·cm-3的色氨酸溶液中，如有K2Cr2O7存在，由于色氨酸的激发和发射峰附近正好是K2Cr2O7的两个吸收峰，K2Cr2O7吸收了色氨酸的激发能和发射的荧光，使测得的色氨酸荧光大大减弱。

自吸收现象：内滤光作用的另一种情况是荧光物质的荧光发射光谱的短波长一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠，在溶液浓度较大时一部分荧光发射被自身吸收，这种现象称为自吸收。2/6/202339溶液的荧光猝灭荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。能引起荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂。猝灭形式：碰撞猝灭静态猝灭（组成化合物的猝灭）转入三重态的猝灭发生电子转移反应的猝灭荧光物质的自猝灭2/6/202340§3-3荧光分析仪结构图3.4荧光分析仪基本部件示意图2/6/202341由光源发出的光经第一单色器得到所需要的激发光波长。激发光通过样品池后，由于一部分光能被荧光物质吸收，其透射光强度将减弱。荧光物质被激发后，将发射荧光。为了消除入射光（透射光）和散射光的影响，荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行。为消除可能共存的其他光线的干扰，如由激发光所产生的反射光、Rayleight(瑞利)散射光和Raman(拉曼)光，以及为将溶液中杂质所发生的荧光滤去，以获得所需要的荧光，在样品池和检测器之间设置了第二单色器。得到的荧光作用于检测器上，得到相应的电信号，经放大后再记录下来。2/6/202342组成激发光源：在紫外—可见区范围，常用的光源是氙灯和高压汞灯。样品池：荧光用的样品池须用低荧光的材料制成，通常用石英，形状以方形和长方形为宜。单色器：较精密的荧光分光光度计均采用光栅，有两个：第一单色器用于选择激发波长；第二单色器用于分离出荧光发射波长。检测器：荧光的强度通常比较弱，因此要求检测器具有较高的灵敏度。一般由光电管或光电倍增管作检测器，并与激发光成直角。(复合光源)直角2/6/202343§3-4荧光分析方法及应用荧光分析方法的特点灵敏度高与紫外—可见分光光度法比较，荧光是从入射光的直角方向检测。即，在黑背景下检测荧光的发射。所以灵敏度要比紫外—可见分光光度法高2～4个数量级。它的测定下限在0.1～0.001μg·cm-3之间。2/6/202344实际工作中用相对灵敏度表示。(i)以喹宁在0.05mol·dm-3H2SO4溶液中的荧光强度为标准，定为1。然后与相同浓度荧光物质的荧光强度进行比较，即可求得该物质的相对灵敏度。(ii)水的拉曼光信噪比表示。选择性强荧光法既能依据特征发射，又能依据特征吸收来鉴定物质。假如某几个物质的发射光谱相似，可以从激发光谱的差异把它们区分开来；而如果它们的吸收光谱相同，则可用发射光谱将其区分。2/6/202345试样量少和方法简便提供比较多的物理参数提供：激发光谱和发射光谱以及荧光强度、荧光效率、荧光寿命等许多物理参数。这些参数反映了分子的各种特性，能从不同角度提供被研究分子的信息。荧光分析方法的弱点应用范围不够广：因为本身能发荧光的物质相对较少，用加入某种试剂的方法将非荧光物质转化为荧光物质来进行分析，其数量也不是很多。干扰因素多：测定时需要严格控制条件。2/6/202346定量测定方法

——标准曲线法用已知量的标准物质经过和试样一样的处理后，配成一系列标淮溶液，在一定的仪器条件下测定这些溶液的荧光强度，作出标准曲线。然后在同样的仪器条件下，测定试样溶液的荧光强度，从标准曲线上查出它们的浓度。2/6/202347荧光分析法的应用目前荧光分析大多用于定量测定。基本方法形成荧光配合物法：利用有机试剂与荧光较弱或不显荧光的物质共价或非共价结合形成发荧光的配合物来进行测定。很多无机阳离子的测定都用此法。荧光猝灭法：某些元素虽不与有机试剂组成发生荧