基因工程原理第4章质粒和噬菌体载体的基础生物学

1思考题什么是基因工程？你对转基因有何看法？发挥想象力，开发一种基因工程产品。主题报告重组DNA技术的应用全班同学分为六个小组：六个主题，可以突破，自己选题，保证与基因工程相关班长负责分组，安排报告时间，从第14周开始。23第四章质粒和噬菌体载体的基础生物学第一节质粒生物学质粒是在染色体外稳定遗传的复制体大多数质粒是以双链环状DNA分子的形式存在共价闭环DNA,cccDNA开环DNA,ocDNA45线性超螺旋开环质粒电泳图谱6质粒酶切图谱7溴化乙锭影响质粒的超螺旋8并不是所有质粒都是环状分子在多种细菌中都发现有线性质粒线性质粒的末端保护机制：在末端DNA发卡环中以重复序列结尾通过共价结合蛋白来保护末端9质粒所携带基因的表型特征10质粒的分类接合型和非接合型依据是否携带有一套促进细菌接合的转移基因（tra基因）松弛型和严谨型取决于单个细胞中的拷贝数1112质粒的宿主范围由它的ori区域决定严格的宿主范围：如ColE1提供的ori的质粒只能在肠细菌中复制广宿主范围：复制所需的蛋白质大部分甚至全部都是自己编码的13质粒的拷贝数通过调控质粒复制的起始来决定。两种调控机制：通过反义RNA调控（RNAII和RNAI）通过关键蛋白与重复区结合来进行调控

Rop促进RNAI和RNAII的配对

RepA蛋白14ColE1衍生质粒的复制调控15pSC101的ori区域RepA蛋白由质粒编码，可以与ori区域的重复区结合，抑制DNA的合成。RepA蛋白通过与自身启动子结合，阻断自身基因转录，抑制自身合成。RepA蛋白通过结合两个质粒的重复区序列把它们连接起来，这样避免它们起始复制。（手铐机制）1617质粒的分配和分离稳定性人们把由于错误的分配而造成的质粒丢失称为分离不稳定性。Par分配机制涉及DNA的超旋性质粒形成多聚体18质粒的不相容性在没有选择压力的情况下，两种质粒不能共存于同一个宿主细胞内。如果质粒拥有相同的复制调控机制，它们就不相容。19第二节质粒DNA的纯化Vinograd的经典方法：CsCl，EtBr密度梯度离心Binrnboim和Doly：碱裂解法20CsCl，EtBr密度梯度离心21碱裂解法NaOH和SDS裂解乙酸钠中和离心，取上清沉淀TER消化RNA沉淀，75%乙醇洗干燥、溶解22质粒产量的影响因素细胞收获时的拷贝数制备清亮裂解液宿主细胞中野生型endA基因23质粒克隆载体的理想特性相对分子量小(易于操作、拷贝数高、利于出现单一酶切位点)可以在宿主细胞内产生便于选择的表型特性(便于筛选)存在多种限制性酶的单一位点区域，且最好位于易测表型基因上(便于克隆、筛选）pBR322载体25pBR322的限制图谱262728pBR322衍生出更好的载体29pUC8质粒衍生自pBR322含有复制起始位点(ori)和另两个基因：氨苄青霉素抗性基因和lacZ’基因30Lac筛选(蓝白斑筛选)pUC质粒含LacZ基因，该酶能分解生色底物X-gal产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入LacZ基因后失活，菌株呈白色，称之为蓝白斑筛选。31pUC8等大肠杆菌质粒的缺点不能操作大于10kb的DNA片段大片段的插入会引起重组或干扰质粒的复制体系，且重组DNA分子在宿主细胞中丢失32第三节λ噬菌体线性的双螺旋分子，大约长48.5kb每个末端都有短的12个核苷酸的单链5’突出，它们在序列上互补，进入宿主细胞后形成环形结构33λ噬菌体的基因组34λ噬菌体非必须DNAλ噬菌体基因组大小为48.5kb，其中有15kb只在噬菌体DNA整合到大肠杆菌染色体过程(即溶源性感染周期)中必须，该片段的删除不影响噬菌体感染细菌的能力，也不影响裂解周期中新的λ噬菌体颗粒合成，称为随意DNA。35λ噬菌体的生活周期36λ噬菌体裂解性感染周期与溶源性感染周期为了能够复制，噬菌体必须进入细菌细胞并促使细菌的酶表达噬菌体基因所包含的信息，以便于细菌能合成新的噬菌体。一旦复制完成，新的噬菌体便离开细菌，并通常引起细菌死亡，并继续感染新的细胞，这称为裂解性感染周期。λ噬菌体基因组整合到细菌染色体上，保持多代的休眠状态，并随细胞分裂而与宿主染色体一起复制，称为溶源性感染周期。3738λ噬菌体的主要启动子和转录终止位点λ噬菌体载体插入型载体(insertionvector)，部分或全部随意DNA被删除，并在删除后的基因组内部某位点引入单一的限制性酶切位点。取代型载体(replacementvector)，随意DNA两侧引入限制性酶切位点，用需克隆的DNA在连入时替代随意DNA。39噬菌体λ克隆载体EMBL3

和EMBL4的结构40λ噬菌体的体外包装4142混合裂解液中串联噬菌体λDNA的体外包装43用单链DNA载体进行DNA克隆M13、f1和fd是包含一个环形的单链DNA分子的丝状大肠杆菌噬菌体。