计算药学第5章(第1,2,3次课的课件,第1,2,3次课讲到第73张幻灯片了,计算药物分析)

第5章分析测试中的质量保证1、质量管理体系和质量保证

2、对照品和标准物质

3、分析采样理论4、分析方法的验证5、杂质分析的指导原则（其中2、4节为重点小节）.药品质量的重要性药物作为一种特殊的商品，其质量直接关系到人民的生命安全和健康水平相关新闻数据显示，全国每年有20万人死于药品不良反应齐二药的亮甲菌素注射液事件安徽华源的“欣弗”事件花样年华葬于“欣弗”之手5.1质量管理体系和质量保证⑴质量保证和质量控制质量保证是个综合过程，涉及到人员、技术、管理等各个方面。国际上经过数百年工业大生产及其质量管理的实践，从早期的个人检查把关，到50年代的统计质量管理和近年来的全面质量管理阶段，在各个行业中已经逐步形成了比较完整和成熟的质量管理体系。GMP、GSP、GCP、GLP等。药品的生产、贮存、运输、销售和使用都必须严格按照这些法令性文件进行全面质量控制和质量保证的科学管理。控制图是经常使用的质量评定技术之一。最常用的控制图是用同一标准方法对同一标准样品测试20次以上，求出其平均值和标准偏差s,在坐标纸上以为x中线，以±2s为警戒线，以±3s为控制限，依次标绘实验点并连成线，即得到控制图。得到控制图以后，日常分析中用标准物质测试的结果如落到控制限以外，就说明-样品测试无效，应找出原因，并采取措施纠正后重新用标准物质校正。5.2对照品和标准物质2、对照品和标准物质不确定度的发展不确定度在国际的发展1927年海森堡仔细分析了微观物理体系的实际行为，提出了指定和测量这类变量所能达到的准确度存在一个基本极限，称之为不确定度关系1963年美国国家标准局提出定量表示不确定度的建议1980年国际计量局作出《实验不确定度的规定建议书INC-1》向各国推荐了不确定度的表达原则，使不确定度在计算上有了共同基础，也使各种计量不确定度的说明有了共同语言，对不确定度的表示方法取得了国际的同一1993年由ISO与BIPM，IEC，IFCC，IUPAC，IUPAP，OIML合作出版《测量不确定度表示导则》（GUM），这是一个应用性指南，在不确定度的术语定义、概念、评定方法和报告时的表达方式上都做出了更进一步的统一规定不确定度在我国的发展1986年中国计量科学研究院发出不确定度应用方法的通知，规定在基准标准研究中，在测量和检定工作中，应采用不确定度作为误差的数字指标。1999年国家计量技术监督局发布了技术规范JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》，作为国家标准公布施行

误差与测量不确定度二者既有联系，又有着本质的区别。误差理论是测量不确定度基础，测量不确定度是经典的误差理论发展和完善的产物。误差是客观存在的测量结果对被测量真值的偏差，是无法准确得到的，测量不确定度与人们对被测量的认识程度有关，是由人们经过分析和评定得到的，可以对测量结果作出定量评定。有可能测量结果的误差很小，但由于认识不足，而认为不确定度很大；也有可能误差较大，由于分析估计不足，相反给出偏小的不确定度

不确定度与误差测量误差测量不确定度定义反映测量结果偏离真值的程度反映测量结果的分散性程度来源随机效应和系统效应随机性和模糊性表示符号非正即负恒为正值获得途径通过约定真值获得估计值由实验、资料、经验评定分类随机误差、系统误差、粗大误差A类评定、B类评定合成方法各误差分量的代数和平方和之后开根结果修正可用系统误差估计值修正结果不能对结果进行修正结果说明属于给定的测量结果属于合理赋予被测量的任意值自由度无作为不确定度评定是否可靠的指标置信概率无需按置信概率给出置信区间测量不确定度的重要性已经得到广泛的认识，一个完整的定量分析结果应该包含不确定度信息，它是定量分析结果的重要组成部分，是评价分析结果可信度的重要参数。此外，测量方法的不确定度在方法学研究等方面也能提供有益的指导，如提供分析过程主要误差的来源信息、解决方案等。化学测量不仅要给出测量过程中所使用的各种参考标准的不确定度，而且要给出测量结果的不确定度

药品检验工作中的作用对照品及标准品数据的标注物理化学常数测定的结果（吸光系数、折光率等）样品测定结果的表示中央药品检验所做的工作。测量不确定度的估算过程开始说明被测量

识别不确定度源

组合现有数据包含的不确定度源进行简化

量化通过组合的组分

量化剩下的组分

将不确定度组分转化为标准偏差

复核

计算合成不确定度

计算扩展不确定度

结束标准不确定度的A类评定贝塞尔公式：其正平方根就表示的分散性。称为样本标准差或实验标准差。测量结果的标准不确定度为计算合成标准不确定度符号

说明

x标准不确定度u(x)相对标准不确定度u(x)/xm水m样终点f水的重量样品的重量终点的偏差温度/湿度的校正因子10mg87.5mg100%10.0960.0960.130.00420.00960.00110.00130.0042计算扩展不确定度Uc按95％置信概率，包含因子κ采用2：最终结果表示为：该样品的水分含量为：（0.09±0.002%）5.3分析采样理论

⑴采样的重要性采样是分析测试工作的笫一步。分析的过程是通过样本研究总体性质的过程，测试结果的误差和采样误差密切相关。当分析测量的不确定度降低到样本不确定度的1／3或者更少时，没有必要再进一步提高分析测试的精密度。

根据误差传递理论，结果误差要取决于精密度最差的单次测量度，仅仅提高单次测量的精密度常常是没有意义的。但人们常常花大力气研究如何改善分析方法的精密度，而忽略了采样方法的正确性。⑵采样方法

采样方法应选取尽可能少的样本而使获结果最大程度地反映被研究总体的特征。对于不同类型的分析对象，取样的具体操作一般都有行业规定的方法。如药品的分析取样，在国家药典附录和《药品生产管理规范实施指南》中都有明确的规定。数理统计方法是正确采样的理论依据。5.4分析方法的验证

5.4.1概述为了保证分析测试结果的可靠性和准确性，必须要有分析方法的标准化和规范化。世界各国和一些国际组织都十分重视分析方法的标准化和规范化。如国际标准化组织（ＩＳＯ）下设近二百个技术委员会，每年都颁布若干新的标准方法，每五年都对已经有的标准方法修订一次；美国官方化学家协会（ＡＯＡＣ）已经研究并颁布了数千种官方标准分析方法；由各国政府组织的药典委员会颁布收载的医药品规格标准即药典是具有法律效力的药品国家标准。对标准方法以及科研工作中建立的方法都应有一定的方法和数据证实其可靠性和可行性。这是所建立的方法能被同行重复和验证，发表以后能被他人应用，得到普及，具有实用价值的重要基础。为了保证分析测试结果的可靠性和准确性，必须对建立的方法进行系统科学的验证(validation)。——方法学研究在医药行业,最早提出对药品检验分析方法进行验证的是美国药典。美国药典从1990年版起增加了一个附录“法定方法的验证(Validationofcompendialmethods)”。按照该项附录的规定，任何一个新方法的建立或改进，都必须有足够的理由说明其必需性，和有足够的资料证明其可靠性和可行性，并经过标准程序的证实，其目的就是把药品检验方法的建立和改进标准化，以保证方法的准确可靠。

新药质量研究的有关规定

现行版药典及ICH

有关文件ICHfilesforquality(Q2，Q3）药典附录:药品质量标准分析方法验证3.药典附录:药品稳定性试验指导原则4.药典附录:杂质分析指导原则5.SFDA:药品注册管理办法(2002-437，号文+附件1、2）6.SFDA:原料药质量研究及质量标准制定指导原则7.SFDA:制剂质量研究及质量标准制定指导原则

5.4.2人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）

人用药物注册技术要求国际协调会议

InternationalConferenceonHarmonizationofTechnicalRequirementsforRegistrationofPharmaceuticalsforHumanUse(1991年建立)筹备:国际协调小组（PDG）：

1989年建立，美国、欧洲、日本

1．ICH成立的背景

不同国家，对新药上市前要进行审批的实现时间是不同的。美国在30年代发生了磺胺醑剂事件，FDA开始对上市药品进行审批；日本政府在50年代才开始对上市药品进行注册；欧盟在60年代发生反应停（Thalidomide）惨案后，才认识到新的一代合成药既有疗效作用，已存在潜在的风险性。于是，许多国家在六、七十年代分别制定了产品注册的法规、条例和指导原则。为了严格管理药品,必须对药品的研制、开发、生产、销售、进品等进行审批，形成了药品的注册制度。随着制药工业趋向国际化并寻找新的全球市场，各国药品注册的技术要求不同，以至使制药行业要在国际市场销售一个药品，需要长时间和昂贵的多次重复试验和重复申报，导致新药研究和开发的费用逐年提高，医疗费用也逐年上升。因此，为了降低药价并使新药能早日用于治疗病人，各国政府纷纷将“新药申报技术要求的合理化和一致化的问题”提到议事日程上来了。不同国家对药品注册要求各不相同，这不仅不利于病人在药品的安全性、有效性和质量方面得到科学的保证及国际技术和贸易交流，同时也造成制药工业和科研、生产部门人力、物力的浪费，不利于人类医药事业的发展。由美国、日本和欧盟三方的政府药品注册部门和制药行业在1990年发起建立ICH美、日、欧开始了双边对话，研讨协调的可能性，直至1989年在巴黎召开的国家药品管理当局会议（ICDRA）后，才开始制定具体实施计划。此后三方政府注册部门与国际制药工业协会联合会（IFPMA）联系，讨论由注册部门和工业部门共同发起国际协调会议可能性。1990年4月欧洲制药工业联合会（EFPIA）在布鲁塞尔召开由三方注册部门和工业部门参加的国际会议，讨论了ICH目标和任务，成立了ICH指导委员会。会议决定每两年召开一次ICH会议，由三方轮流主办。第一次指导委员会协调了选题，一致认为应以安全性、质量和有效性三个方面制定的技术要求作为药品能否批准上市的基础，并决定起草文件。同时，每个文件成立了专家工作组（EWG），讨论科学技术问题。后来，随着工作的深入开展，认为电子通讯和术语的统一，应作为互读文件的基础。因此，增加了“综合学科”，并成立了子课题。2．概况及组织机构

ICH是由欧盟、美国和日本三方的药品注册部门和生产部门组成，六个参加单位分别为：

---欧盟，EuropeanUnion(EU)

---欧洲制药工业协会联合会，EuropeanFederationofPharmaceuticalIndustriesAssociations(EFPIA)

---日本厚生省，MinistryofHealthandWelfare，Japan(MHW)

---日本制药工业协会，JapanPharmaceuticalManufacturersAssociation(JPMA)

---美国食品与药品管理局，USFoodandDrugAdministration(FDA)

---美国药物研究和生产联合会，PharmaceuticalResearchandManufacturersofAmerica(PRMA)

世界卫生组织（WorldHealthOrganization,WHO）、欧洲自由贸易区（EuropeanFreeTradeArea,EFTA）和加拿大卫生保健局（CanadianHealthProtectionBranch,CHPB）作为观察员；国际制药工业协会联合会（InternationalFederationofPharmaceuticalManufacturersAssociations,IFPMA）作为制药工业的保护伞组织参加协调会。ICH秘书处设在日内瓦IFPMA总部。ICH由指导委员会、专家工作组和秘书处组成：

（1）指导委员会（theStreeringCommittee,SC）

指导委员会共有14名成员，由六个参加单位和IFPMA各派两名代表组成。指导委员会主要领导ICH会议并协调工作进展。每年召开2-3次会议，分别由主办国管理部门的代表主持会议，三个观察员组织可分别排1名代表列席指导委员会会议。指导委员会对2和4两个关键阶段进行讨论，做出决定。

（2）专家工作组（ExpertWorkingGroups,EWG）专家工作组是指导委员会的技术顾问，六个主办单位对每个起草文件的专题派若干专家参加，其中1名任专题组长。

(3）秘书处秘书处设在日内瓦IFPMA总部。主要负责指导委员会及专家工作组会议的准备工作和有关文件的起草，并负责与各组的协调员联系，以保证将讨论的文件按时发送到有关人员。药品质量控制规范文件通用方法赋形剂（12个品种）标准的统一减少动物试验加强体内等效性研究注重提高维生素等营养保健药品的质量加强药品安全保障(说明书的规范化等)新分析检测技术的发展和应用3.ICH协调工作的原则及进展协调的专题共分四个类别：

---安全性（safety，包括药理、毒理、药代等试验），以“S”表示，现已制定16个文件；---质量（Quality，包括稳定性、验证、杂质、规格等），以“Q”表示，现已制定12个文件；---有效性（Efficacy，包括临床试验中的设计、研究报告、GCP等），以“E”表示，现已制定14个文件；---综合学科（Multidisciplinary，包括术语、管理等），以“M”表示，现已制定4个文件。

Quality

Safety

Efficacy

AnalyticalValidationImpuritiesStabilitytestsguidanceforsettingspecificationsfornewdrugsandproductsICH已就药品安全性、质量、有效性等颁发了近50个文件，其中有关药品的质量及稳定性、标准方法验证等内容的文件以“Q”编号，和我们分析质量控制密切相关的主要是Q开头的10余个文件；其中Q2A介绍了有关分析方法质量控制的术语，Q2B则介绍了方法学研究的具体要求和方法。目前，这两个文件已成为国际公认的对医药品分析方法进行验证的基本原则。5.4.3药品质量标准分析方法验证（中国药典2000、2005年版附录ⅩⅨA

）1、概述目的：证明方法的科学性和可行性， 符合相应检测要求要求：按规定分析项目和验证内容设计和完成实验过程和结果均应记载在药品标准研究资料中

意义:规范化、科学性、通用性应用：验证分析方法药品质量标准起草。生产工艺或制剂处方变更时对原分析方法修订。证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求规定了建立或改进方法必须按标准格式递交报告；要求清楚地介绍建立或改进方法的目的、必要性及其特点，完整地叙述方法，列出所需的仪器、试剂药品、操作步骤、注意事项、计算公式等；要求列出按标准程序对分析方法进行验证的方法、数据和结论，以充分证实所建立分析方法的可靠性和可行性。2、需验证的分析项目

⑴鉴别试验；

⑵杂质定量或限度检查；

⑶原料或制剂中有效成分含量测定；

⑷制剂中其它成分（降解产物、防腐剂等）的测定；⑸溶出度、释放度等检查中的溶出量等的测试方法。

3、验证内容准确度、精密度（重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性⑴准确度（accuracy）准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。

测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”。

回收试验空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M

加样回收试验已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M

数据要求规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备高、中、低三个不同浓度样品各测三次。①含量测定方法的准确度

原料药可用已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。

制剂可用含己知量被测物的各组分混合物进行测定，即采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法。如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，或与另一个已建立准确度的方法比较结果。

中药分析的准确度一般用加样回收试验衡量。中药回收率一般要求在95～105%范围内，有些方法操作步骤繁多时，可要求在90～110%范围内。RSD一般在2%以内。②杂质定量测定的准确度可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。如果不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较。

⑵精密度（precision）精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差（d）、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)（变异系数，CV）表示。允许误差

容量分析（中和法、非水滴定法、银量法、络合滴定法、重氮化法、氧化还原法）≤0.3%；重量法≤0.5%；氧瓶燃烧法≤0.5%；凯氏定氮法≤1%;仪器分析≤3%①重复性(repeatability):在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度；在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次或把被测物浓度当作100%，至少测6次进行评价。②中间精密度同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。③重现性(reproducibility)不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。

数据要求：需报告RD，RSD和可信限。

⑶检测限（limitofdetection，LOD）

检测限系指试样在确定的实验条件下，被测物能被检测出的最低浓度或含量。属限度检验效能指标，无需定量测定，只要指出高于或低于该规定浓度即可。

①非仪器分析目视法用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。②信噪比法用于能显示基线噪音的分析方法（仪器分析方法），是把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比（S/N）3∶1或2∶1时的相应浓度或注入仪器的量确定检测限。

（1）空白值＝0时；①测定背景10次以上，求出标准差σb。②将σb乘以三倍；③在工作曲线上求出3σb相对应的浓度Xb；即为方法的检出值；

（2）空白值不等于0；①测定背景10次以上，求出标准差σb；②将σb乘以三倍；③在工作曲线上求出3σb相对应的浓度Xb；④将求得的对应浓度值加上空白值即得该方法的检出限。

⑷定量限（1imitofquantitation，LOQ）指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度要求。

常用信噪比法确定定量限，一般以信噪比（S/N）为10∶1时相应的浓度或注入仪器的量进行确定，也可按1984年国际纯粹和应用化学联合会(IVPAC)规定：用仪器所测空白背景响应标准差（SD）的10倍为估计值，再经试验确定方法的实际测定下限。

仪器分析：通过测定一组空的样品的背景信号后计算标准差S。以1OS来估算定量限度。（以定量限度制备的样品来验证）

非仪器分析：通过分析己知被测物浓度的样品并确定一个样品中被测物可被准确和精密测定出的最低浓度（量）。

注意问题检测限、定量限和灵敏度的区别消除空白的局限性检测限、定量限和灵敏度的区别

检测限（detectionlimit）系指试样中被测物能被检测出的最低量；定量限（quantitationlimit）系指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具定量分析方法应达到的准确度和精密度。灵敏度(sensitivity)指的是分析信号随组分含量变化的大小。一个分析方法的灵敏度常用校正曲线的斜率表示。校正曲线的斜率越大，单位浓度信号改变值越大，则方法灵敏度越高。严格来说，方法的灵敏度还和实验点的分布有关，若实验点和校准点的误差即残差的标准偏差为SE，则可按斜率／SE计算灵敏度。这里应注意灵敏度并不表示该方法最低检测的量。离子选择性电极法：

灵敏度和测定离子电荷有关；

检测限则根据电极响应原理和响应膜的溶度积有关如电极法测定Ｃｌ-，反映灵敏度的响应斜率为５８ｍＶ／ｐＣｌ，检测限约为２ｐｐｍＣｌ；而测定Ｃｄ＋２的响应斜率为２９ｍＶ／ｐＣｄ，检测限约为0.005ｐｐｍ。若Ｃｌ-和Ｃｄ2+的校准曲线残差的标准偏差基本相同，测定Ｃｌ-的灵敏度比测定Ｃｄ2+要高一倍，但检测限要比测Ｃｄ2+差得多。

消除空白的局限性

分析空白往往对痕量分析的准确度、精密度和检测下限起着决定性的作用。

分析空白广义上实际包括样品的玷污（正空白）、样品的损失（负空白）和仪器噪音。在痕量和超痕量分析中，把样品的玷污而引起的正空白称为分析空白。分析空白对痕量分析结果的准确度起着决定性的作用，其影响程度和被测组分的含量水平直接有关。10±5ng空白值对测定结果准确度的影响若为常规分析，应该预先建立起分析空白的控制图，扣除控制图中的空白统计平均值；若未能建立控制图，也应该扣除空白值，空白值应取对多个空白样本测试的空白平均值。

⑸专属性（specificity）选择性（selectivity）的量度

指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，是指该法用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量。

①鉴别反应

能与可能共存的物质或结构相似化合物区别，不含被分析的样品，以及结构相似或组分中的有关化合物，均应呈负反应。

问题:比较以下鉴别方法的专属性

官能团化学鉴别;

高效液相色谱保留;

薄层液相色谱比移值;

紫外分光光度法;

红外分光光度法

②含量测定和杂质测定

加有杂质、降解产物、有关化学物质或安慰剂成分的样品。

破坏性试验

粗品

所获分析结果与未加前述成分之样品的测试结果进行比较，两组测试结果的差别即反映方法的专属性。

色谱法和其他方法，应附代表性图谱，亦说明专属性。图中应标明各组份的位置，色谱法中的分离度应符合要求

⑹线性（Linearity）

在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。

线性通常用最小二乘法处理数据求得回归曲线的斜率来表示。数据要求：至少需要5个浓度考察线性，需提供相关系数，列出回归方程和线性图。

一般|γ|>0.99，可认为线性关系可符合常规分析要求。亦可由根据实验数据拟合的方程y=axn+b中n的大小来确定；有文献报道应用色谱定量方法时0.9<n<1.1可认为线性符合要求。⑺范围（Range）：指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高、低限浓度或量的区间。范围的确定可因测定项目不同而有不同要求：含量测定和溶出度范围为80%-120%；含量均匀度范围为70%-130%；杂质测定应为被测杂质限度的50%-120%.图5-6线性范围的定义⑻耐用性稳健性（robustness）和耐用性(ruggedness）一个好的分析方法应该不受环境等因素的变更而改变结果，即对各种外界因素不灵敏，在各种条件下，如在不同的实验室、分析者、仪器型号、试剂批号、时间、温度等条件下，都应得到一致的结果。如果对各种条件过于灵敏，在测试过程中就要严格控制这些条件，还提高了测试成本。这种考察试验可包括两方面的内容:一是考察应用方法条件本身重复实验对结果的影响，二是鉴别必须仔细控制的实验条件和环境条件。例如，某高效液相色谱方法要求流动相为ｐＨ３缓冲液－甲醇（４：６），则建立方法时除了用该条件反复测试进行方差分析考察方法的精密度外，还可用析因试验考察缓冲液ｐＨ２.９、３.１，甲醇５９、６１％等条件稍微变化下对实验结果的影响，计算结果的统计误差，考察ｐＨ值和甲醇％改变对结果的影响。对分析方法的验证包括了稳健性和耐用性试验。稳健性（robustness）系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。一般属于实验室内方法研发和验证环节.例如，研究测定条件的改变包括流动相的组成、流动相的pH、浓度和色谱柱等的变化对结果的影响。经常要通过系统的多因素两水平实验设计，如Plackett-Burman设计，对实验结果的优化指标予以考察。为提高效率，经常采用不完全因子设计，对7因子设计需要8个实验，11因子设计需要12个实验。如果设计因子中包含分析者，仪器及实验室，这种稳健试验也就是通常所说的耐用性试验。耐用性(ruggedness）广义来说是指同一样品分析结果的再现性。耐用性的含义不仅要求方法的稳定，而且包含了重复性，即当方法用于不同的分析者，实验室以及仪器时所产生相近结果的能力。耐用性测定要在实验室内外分别进行。经常要求一个分析方法被8个或更多的实验室用于分析相同的样品。耐用性试验不仅仅是考察仪器系统的影响，而且还有样品处理，样品溶液制备和流动相配制等等多种影响因素，实验结果要应用统计分析予以全面评估，能够更加全面反映分析方法在不同实验条件下性能的稳定。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性，样品提取次数、时间等。液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成和pH值，不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱，柱温，流速等。气相色谱法变动因素有：不同厂牌或批号的色谱柱、固定相，不同类型的担体、柱温，进样口和检测器温度等。4、应用范围4、应用范围⑴鉴别试验除专属性、耐用性外，其它都不要求。⑵

杂质的限量检查除专属性、检测限、耐用性外，其它都不要求。杂质的含量测定除检测限外，其它都要求。⑶含量测定及溶出量测定除检测限、定量限外，其它都要求。5、分析方法验证的具体要求⑴容量分析法(即滴定分析法)用原料药精制品(含量>99.5％)或对照品考察方法的精密度，相对标准差一般应不大于0.2％；进行回收率试验，回收率一般在99.7～100.3％之间。

⑵UV法：用适当浓度的精制品进行测定，其RSD一般不大于1％。制剂的测定，回收率一般应在98％～102％之间。

线性：吸光度A一般在0.2～0.7，浓度点n＝5。用浓度c对A作线性回归处理，得一直线方程，r应达到0.9999(n＝5)，方程的截距应近于零。⑶HPLC法：要求RSD<2％，回收率98％～102％之间。线性范围：用精制品配制一系列标准溶液，浓度点n应为5～7，用浓度c对峰高h或被测物的响应值之比进行回归处理，建立回归方程，r应大于0.999，截距应趋于零。5.4.4分析方法验证的统计分析

1.一元线性回归分析的验证对线性的评价(置信区间的计算)检测限的计算对线性的评价用在定量范围内测得的工作曲线斜率的方差比较合理。根据n个实验点的数据可分别计算残差的标准差Sy/x、斜率的标准差Sb和截距的标准差Sa。增加重复测定次数m和实验点数n，都能减小置信区间，提高测试准确度的可靠性。例5-4用荧光分光光度法测试标准荧光素水溶液的荧光强度数据如下：

c(µg／µ1)024681012荧光强度2.15.09.012.617.321.024.7(1)计算一元线性回归方程，并计算截距和斜率的置信区间。(2)若测得3份样品液荧光强度分别为2.9，13.5和23.O，试计算其含量和置信区间。(3)计算用本法测试的检测限。2．分析方法的比较

在考察建立方法的准确度时，若能找到已有的标准方法单未获得标准样品。则可按已确认的标准方法平行测试作为标准值来对照检查被检验的方法是否存在系统误差，并进行比较。统计检验作图法检验3.两条回归直线的比较在例行分析中应用比色法测试经常需要对标准曲线是否需要校正进行检查，对不同来源的标准溶液测得的工作曲线是否一致，有时也需进行比较。在应用标准加入法进行回收率试验时要比较两种回归直线。所谓回归直线的比较，就是检验回归直线的两个参数－斜率和截距是否一致。

4.标准加入法和基体效应

一般的校正曲线在背景干扰可以消除、测试信号不随其它组分浓度改变时才可使用。当一个分析方法应用于不同样品时，对于不同的测试对象常常需要考虑基体的影响。基体对待测组分的影响称为基体效应，基体效应的大小对于选择合适的分析方法有很大的影响。例5-5现欲测试未知溶液中的铜氨络离子浓度，把未知样品分成5份，分别加入不同量的铜氨络离子，其浓度c和测得的吸收度结果如下：

c(mmol／L)O.03.06.09.O12.0A0.330.450.6lO.74O.85

【解】绘制校正曲线如图5-8。回归线外推至x轴和原点间的距离，即在x轴上的截距表示原始样品中的铜氨离子浓度，-O.007表示需要加入7mmol／L浓度的铜氨络离子才能使吸收值的读数为零；如果不用图解法也可以用公式计算原始样品中的浓度c：c=a／b(5-29)这里a是回归线的截距，b是回归线的斜率。本例中回归线方程为y=O.3300+0.04433x，则c=O.3300／O.04433=7.444mmol／L,与外推图解法的结果一致，且精密度较高。一般用标准物质测试的校正曲线仅能在基体效应可以忽略时才能使用。如果基体效应影响测定结果，但是影响不是很大时，可以用标准加入法来消除存在的基体效应。

在实际分析测试中，有时没有和基体匹配的标准物质，此时如用纯物质配制的标准溶液绘图制校正曲线，而待测溶液测试时其中的基质将会引起较大的误差。如显影废液中的含银量，使用硝酸银标准溶液绘制标准曲线进行计算将可能有较大的误差。常用的解决方法是在显影废液中加入不同浓度已知量的银盐，作为标准系列绘制标准曲线。这种方法称为标准加入法。!杂质是其中的一个关键因素！究竟有哪些因素在影响药品的质量？杂质是影响药品质量的重要因素中国药典VS美国药典中国应加强对制剂的质量控制!中国药典(2005版)《药品杂质分析指导原则》？国际人用注册药品协调会（ICH）Q3A、Q3B、Q3C杂质分析的指导原则杂质研究指导原则.pdf5.4.5附录ⅩⅨF药品杂质分析指导原则

药品的特殊杂质（即有关物质）系指某一药品中独特存在的杂质，一般为在制备或贮存中根据其方法或其性质可能产生的某一杂质。这些杂质的检查方法列入各药品的检查项下。常用的特殊杂质检查方法除化学方法外包括各种仪器方法，如色谱法及分光光度法。近年来高效液相色谱法被越来越多地在特殊杂质的检查项目中予以使用。有关物质检查提高纯度保证安全有效的重要指标有关物质分为

一般物质和特殊杂质产生原因：全过程

检测方法：专属性强、灵敏度高、重复性好；首选色谱法，更多使用联用技术6.新药报批中最容易出现的问题回收率试验不符合要求；不做中间精密度试验；检测限计算错误；杂质测定用主成分研究。1．杂质的分类及其名称按化学类别和特性，杂质可分为：有机杂质、无机杂质、有机挥发性杂质。按其来源，杂质可分为：有关物质（包括化学反应的前体、中间体、副产物和降解产物等）、其他杂质和外来物质等。按结构关系，杂质又可分为：其他甾体、其他生物碱、几何异构体、光学异构体和聚合物等。按其毒性，杂质又可分为毒性杂质和普通杂质等。普通杂质即为在存在量下无显著不良生物作用的杂质，而毒性杂质为具强烈不良生物作用的杂质。如磷酸可待因中的“吗啡”，氯贝丁酯中的“对氯酚”，盐酸苯海索中的“哌啶苯丙酮”，盐酸林可霉素中的“林可霉素B”以及胰蛋白酶中的“糜蛋白酶”等。如果该杂质的化学名太长，又无通用的简称，可参考螺内酯项下的“巯基化合物”、肾上腺素中的“酮体”、盐酸地芬尼多中的“烯化合物”等，选用相宜的项目名称。在质量标准起草说明中应写明已明确杂质的结构式。(1)检查对象明确为某一物质时，就以该杂质的化学名作为名称，（2）检查对象不能明确为某一单一物质而又仅知为某一类物质时，则其名称可采用“其他甾体”、“其他生物碱”、“其他氨基酸”、“还原糖”、“脂肪酸”、“芳香第一胺”、“含氯化合物”、“有机溶剂残留量”或“有关物质”等。（3）未知杂质，仅根据检测方法选用项目名称，如“杂质吸收度”“易氧化物”、“易炭化物”、“不挥发物”、“挥发性杂质”等。新原料药和新制剂中的杂质，应按国家有关新药申报要求进行研究，也可参考ICH（人用药品注册技术要求国际协调会）的文本Q3A（新原料药中的杂质）和Q3B（新制剂中的杂质）进行研究，并对杂质和降解产物进行安全性评价。新药研制部门对在合成、纯化和贮存中实际存在的杂质和潜在的杂质，应采用有效的分离分析方法进行检测。对于表观含量在0.1%及其以上的杂质以及表观含量在0.1%以下的具强烈生物作用的杂质或毒性杂质，予以定性或确证其结构。2．质量标准中杂质检查项目的确定

对在稳定性试验中出现的降解产物，也应按上述要求进行研究。新药质量标准中的杂质检查项目应包括经研究和稳定性考察检出的，并在批量生产中出现的杂质和降解产物，并包括相应的限度。除降解产物和毒性杂质外，在原料中已控制的杂质，在制剂中一般不再控制。原料药和制剂中的无机杂质，应根据其生产工艺、起始原料情况确定检查项目，但对于毒性无机杂质，应在质量标准中规定其检查项。在仿制药品的研制和生产中，如发现其杂质模式与其原始开发药品不同或与已有法定质量标准规定不同，需增加新的杂质检查项目的，应按上述方法进行研究，申报新的质量标准或对原质量标准进行修订，并报有关药品监督管理部门审批。共存的异构体和抗生素多组分一般不作为杂质检查项目，作为共存物质，必要时，在质量标准中规定其比例，以保证生产用的原料药与申报注册时的一致性。但当共存物质为毒性杂质时，该物质就不再认为是共存物质。单一对映体药物，其可能共存的其他对映体应作为杂质检查。消旋体药物，当已有其单一对映体药物的法定质量标准时，应在该消旋体药物的质量标准中设旋光度检查项目。3．杂质检查分析方法和杂质的限度

杂质检查分析方法应专属、灵敏。杂质检查应尽量采用现代分离分析手段，主成分与杂质和降解产物均能分开，其检测限应满足限度检查的要求，对于需作定量检查的杂质，方法的定量限应满足相应的要求。杂质检查分析方法的建立应按本药典的要求作方法验证。在研究时，应采用几种不同的分离分析方法或不同测试条件以便比对结果，选择较佳的方法作为质量标准的检查方法。杂质检查分析方法的建立，应考虑普遍适用性，所用的仪器和试材应容易获得。对于特殊试材，应在质量标准中写明。在杂质分析的研究阶段，可用可能存在的杂质、强制降解产物，分别或加入主成分中，配制供试溶液进行色谱分析，调整色谱条件，建立适用性要求，保证方法专属、灵敏。新药研究中的杂质和降解产物，或在非新药中发现的新杂质和新降解产物，应进行分离纯化制备或合成制备，以供进行安全性和质量研究。对确实无法获得的杂质和降解产物，研制部门应在申报资料和质量标准起草说明中写明理由。在用现代色谱技术对杂质进行分离分析的情况下，对已知杂质和毒性杂质，应使用杂质对照品进行定位，如无法获得该对照品时，可用相对保留值进行定位。应使用多波长检测器研究杂质在不同波长下的检测情况，并求得在确定的一个波长下，已知杂质，特别是毒性杂质对主成分的相对响应因子。已知杂质或毒性杂质对主成分的相对响应因子在0.9～1.1范围内时，可以用主成分的自身对照法计算含量，超出0.9～1.1范围时，宜用对照品对照法计算含量。也可用经验证的相对响应因子进行校正后计算。未知杂质的定量可用主成分自身对照品法进行计算。杂质定量计算方法应明确规定在质量标准中。一般，质量标准中还应有单个杂质限量和总杂质限量的规定。在用薄层色谱分析杂质时，可采用杂质对照品或主成分的梯度浓度溶液比对，杂质斑点进行半定量评估，质量标准中应规定杂质的个数及其限度。杂质斑点进行半定量评估，质量标准中应规定杂质的个数及其限度。由于色谱法杂质限度检查受色谱参数设置值的影响较大，有关操作注意事项应在起草说明中写明，必要时，可在质量标准中予以规定。杂质限度的制订应考虑如下因素：杂质