第10章 合子胚培养 - 副本

第10章合子胚培养1合子胚培养的概念1.1植物胚胎培养的概念植物胚胎培养是指对植物的胚、子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。

1.2合子胚培养的概念合子胚培养是指在无菌条件下分离和培养有性胚，以期获得可育植株的一种技术。1904年，Hannig最早在无菌条件下进行了离体胚培养实验（辣根菜和胡萝卜的成熟胚）。依靠合子胚培养技术，现在已经能够挽救早熟败育的杂种胚。

2胚培养的类型2.1成熟胚培养培养基和培养条件：培养基只需含无机盐和糖即可；提供合适的生长条件及打破休眠。培养技术：成熟胚培养技术也要求不严操作：受精后的果实或种子（带种皮）表面消毒剥离种胚培养完整植株。发育途径：主要是直接形成幼苗2.2幼胚（未成熟胚）培养幼胚指的是尚未成熟即发育早期的胚。特点：培养困难，对培养基的要求复杂对培养技术和培养条件的要求较高幼胚培养发育途径：（1）继续正常的胚胎发育过程，维持胚性生长，最终形成具有萌发能力的成熟胚。进行幼胚培养时，关键是维持胚性生长（此途径为需要途径）。为了保证离体幼胚能沿着胚胎发生的途径发育，其对营养的需求较成熟胚复杂。（2）不能维持胚性生长，迅速萌发为幼苗。幼胚未经完成正常的胚胎发育过程而形成幼苗的现象称为“早熟萌发”(precociousgermination，不需要)。（3）形成愈伤组织。若形成愈伤组织，愈伤组织可再分化形成植株。3合子胚培养的技术措施3.1材料的选择与灭菌（p157）（1）幼胚培养

选材：因植物类型及实验目的的不同而不同表面消毒：对受精后子房进行表面消毒（2）成熟胚培养：取成熟的果实或种子进行表面消毒，再分离胚进行和培养。3.2胚的分离及培养3.2.1胚的分离成熟胚的剥离：较容易幼胚的剥离（p157～158）：表面消毒切开子房壁取出胚珠剥离珠被取出完整幼胚培养3.2.2胚的培养成熟胚的培养：只需提供合适的生长条件及打破休眠，即可在比较简单的培养基上萌发生长，形成幼苗。故培养基只需含无机盐和糖即可。另外，成熟胚培养技术也要求不严。未成熟胚的培养：要求的技术和条件较高。胚胎发育过程可分为两个时期：异养期和自养期。胚由异养转入自养是其发育的关键时期。在这两个时期之内，培养中的胚对外源营养的要求随胚龄的增加而逐渐趋向简单（p153，表9.1）。在人工培养基上幼胚培养难成功，利用胚乳看护培养（为什么？），可显著提高幼胚的成活率。可用同种胚乳，也可用异种胚乳（p159）。4影响胚培养的因素4.1培养基4.1.1无机盐用于胚培养的无机盐配方很多，对其中每种成分的作用并无精确的评价。

成熟胚培养中，主要采用一些较简单的培养基，如Tukey、Randolph、White等。幼胚培养的培养基主要有MS、B5、Nitsch、Rijven、White、Rangaswang、Norstog等。根据Monnier(1976)的研究，在一定的培养基上，未成熟胚的生长和存活之间并不存在相关性（p161，图9.4），并设计了新的培养基（p154～155，表9.3）。另据Umbeck和Norstog(1979)报道，培养基中的NH4＋对于大麦未成熟胚的正常生长和分化是必需的。4.1.2碳水化合物和培养基的渗透压种类：蔗糖最好浓度：因胚的发育时期而有所不同。成熟胚在含2％蔗糖的培养基中就能很好生长；幼胚则要求较高水平的糖浓度（一般为8％～12％），如果浓度过低，会引起幼胚过早萌发。在长期的培养过程中，随着培养时间的增加，必须把胚转移到蔗糖水平逐步降低的培养基中。蔗糖不仅是作为一种能源，而且是为了保持适当的渗透压，后者对于未成熟胚的培养来说尤为重要。

另有观点认为，胚在离体条件下的生长和分化在很大程度上并不依赖于渗透压的大小，而主要取决于某些生长调节物质的存在与否。4.1.3氨基酸和维生素在胚培养中加入氨基酸，无论是单一的还是复合的，都能刺激胚的生长。加单一氨基酸时，以谷氨酰胺最有效。水解酪蛋白(CH)是一种氨基酸复合物，一直被广泛用于胚培养。胚对水解酪蛋白的敏感性因物种而异。常用于胚培养的维生素类有硫胺素、吡哆醇、烟酸、泛酸钙等。维生素对发育初期的幼胚培养是必需的，但对已萌发生长的胚，可能对其形态发生有抑制作用。

4.1.4植物生长调节剂除了在某些植物中为了打破休眠以外，没有证据表明离体的成熟或未成熟胚的正常发育需要外源生长调节物质。实际上，生长素对于胚的生长通常表现抑制作用。如果为了由胚和胚段诱导愈伤组织，则通常都须在培养基中加入生长素或细胞分裂素，或二者都加。4.1.5天然有机物正常植物体上，胚的生长受胚乳滋养，因此，加入一些天然的胚乳或种子提取物，对离体胚的生长有促进作用。某一植物的胚乳组织提取物对该植物胚的生长较好。

其它如椰子汁、番茄汁等有较好效果。4.1.6培养基的pH培养基的pH对胚的培养也有一定的影响。例子：如荠菜离体胚在pH值为5.4～7.5的培养基中都能正常生长。对紫花曼陀罗心形早期的胚培养最适pH值在5.0～7.5的范围内。8日龄的水稻胚在pH值5和9时，生长最好。Norstog和Smith(1963)报道，培养基的pH值对于大麦未成熟胚的器官分化是关键因素，最适值约为4.9。4.2培养条件4.2.1温度大多数植物胚培养的温度为25～30℃，但也有些植物需要较低或较高的温度。如：马铃薯：20℃；香子兰(Vanillafragrans)：32～34℃；柑橘、苹果、梨：25～30℃；棉花：32℃；桃：胚培养需在变温条件下进行4.2.2光照由于胚在胚珠内的发育是不见光的，所以一般认为在黑暗或弱光下培养幼胚比较适宜，光对胚胎发育有轻微的抑制作用。离体培养条件下进一步发育的幼胚对光的需求，因植物种类而异。4.3胚柄胚柄的形态结构：p158，图9.1有关胚柄的结构、细胞学和生理生化的详细研究表明，胚柄积极参与幼胚的发育过程。有研究指出在幼胚培养中，胚柄的存在对幼胚的存活是关键。使用生长调节物质，如5mg／L赤霉素能有效地取代胚柄的作用。当没有胚柄存在时，一定浓度范围的KT可促进幼胚的生长，但其作用难与赤霉素相比。但Monnier(1978)的观点是，无胚柄的极幼龄胚所以难于培养，是由于在除掉胚柄时所引起的损伤造成的。5胚培养的应用5.1通过“胚拯救”获得远缘杂种通过“胚拯救”即可克服这种受精后障碍，产生远缘杂种。“胚拯救”的方式有三种：5.1.1杂种幼胚在人工培养基上培养在发生“受精后障碍”的情况下，若把杂种胚在开始夭折之前剥离出来，置于一种适当的人工培养基上培养，则杂种胚常常表现出正常生长的潜力，最终长成杂种植株（p172）。例子：草木犀、百合、车轴草属、稻属植物、番茄等如果胚的夭折发生在发育的极早期，由于人工培养基很难取代天然胚乳的作用，采用以上方法拯救杂种仍会遇到很大困难，在这种情况下，则可尝试胚乳看护培养法（p172～173）。5.1.2杂种幼胚的胚乳看护培养在以上两种方法皆难奏效的情况下，则可尝试杂种幼胚愈伤组织培养法，即先把杂种幼胚诱导成愈伤组织，经过或长或短的继代培养之后，再诱导杂种愈伤组织分化植株（p173）。5.1.3杂种幼胚的愈伤组织培养步骤：有性杂交杂种幼胚培养杂种愈伤组织形成愈伤组织增殖茎芽分化植株再生例子：小麦×簇毛麦、大麦×小麦、栽培番茄×智利番茄等5.2获得单倍体在远缘杂交之后，通过染色体的定向消除而产生单倍体，是胚培养的另一项新用途（p175）。例子：栽培大麦×球茎大麦5.3打破种子休眠，缩短育种周期许多植物的种子发育不完全或有抑制物存在而影响种胚发芽。而通过幼胚培养，可促使这些植物的幼胚达到生理和形态上的成熟而提早萌发，形成植株。

在有些情况下，园艺植物如落叶树的育种工作，会因种子休眠期太长而延误。通过胚的离体培养，可使休眠期缩短（p176）。

5.4提高种子萌发率，繁殖稀有物种长期营养繁殖的植物具有形成种子的能力，但其生活力较