食品理化检验 霉菌毒素检验

霉菌毒素的检验掌握：黄曲霉毒素的理化性质和薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1的原理和方法微柱筛选法测定AFTB1的原理及方法赭曲霉毒素的理化性质和薄层色谱法测定的原理及方法熟悉：展青霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素、玉米赤霉烯酮的测定方法了解：霉菌毒素的命名、分类、危害和污染来源概述黄曲霉毒素的检验赭zhě曲霉毒素

展青霉素脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇

T-2毒素玉米赤霉烯酮的测定方法目录霉菌及霉菌毒素霉菌：是丝状真菌的俗称，意即"发霉的真菌"，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不象蘑菇那样产生大型的子实体。常见毒性大的霉菌毒素：黄曲霉毒素（AFT）、杂色曲霉素、赭曲霉毒素、伏马菌素、展青霉素、桔青霉素、玉米赤霉烯酮霉菌毒素的命名与分类按照产生毒素的霉菌名称来命名按毒作用部位分肝脏毒素肾脏毒素神经毒素类似性激素作用物质按毒素来源分曲霉毒素青霉毒素镰刀菌毒素霉菌毒素的分类按毒作用机理抑制蛋白质合成类作用于离子通道类作用于细胞骨架类作用于细胞突触类霉菌毒素的分类按毒素结构分二呋喃环内酯环醌类霉菌毒素的产生条件水分

pH

温度湿度氧气霉菌毒性与危害肝、肾、神经、生殖、消化系统的损害免疫抑制、细胞毒性致癌、致畸、致突变，如黄曲霉毒素能诱发人、猴、鼠、禽类发生肝癌，致癌所需时间最短为24周。第二节黄曲霉毒素的检验黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)

黄曲霉、寄生霉和温特霉的代谢产物剧毒物，其毒性是氰化钾的10倍，为砒霜的68倍，是目前发现的最强的化学致癌物质之一黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强高温高湿地区生产的花生、玉米、大米、棉籽等最容易被污染基本结构：二呋喃环和香豆素产生荧光颜色不同，可分为B族（蓝色）和G族（绿色）两大类及其衍生物主要存在于牛奶中AFTB1及其衍生物AFTG2及其衍生物黄曲霉毒素的理化性质耐热，高于280℃裂解；耐光，不耐氧化剂难溶于水，乙醚、石油醚，易溶于甲醇和氯仿在碱性条件下，其结构中的内脂环可被破坏形成香豆素钠盐，该盐能溶于水，无毒。在酸性条件下，能发生逆反应，恢复其毒性。其反应式为：黄曲霉毒素B1黄曲霉毒素的分析方法TLC酶联免疫吸附法（ELISA）微柱筛选法HPLC国标法薄层色谱法—单向展开法样品中AFTB1经甲醇-水溶液提取后，浓缩、定容、点样于硅胶G薄层板上，经展开分离后，在波长365nm紫外光下观察蓝紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的强度与标准比较来确定含量。样品处理样品→加正己烷（或石油醚）和甲醇-水溶液，震荡→分层，取甲醇-水层→氯仿萃取→无水Na2SO4→过滤→滤液蒸干→苯-乙腈溶解→备用点样

在距薄层板下端的2cm基线上用微量注射器滴加样液，标液，一块板滴加4个点，点的直径～3mm，大小一致，在一条直线上。滴加样式如下：

第一点第二点第三点第四点样液

—

20

20

20

μl淡标

(0.04μg/ml)

10

—

10

—

μl浓标

(0.2μg/ml)—

—

—

10

μl

（最低荧光点）（样点）（荧光定位）预展及展开

预展，12cm无水乙醚展开10～12cm

丙酮：氯仿

8：92观察及确证365nm若Rf=0.6附近有蓝紫色荧光确证点样后，在点样处滴加三氟乙酸Rf=0.1附近有蓝紫色荧光展开、紫外灯下观察AFTB1→AFTB2a极性增大确证点样操作第一点第二点第三点第四点样液μl—20—20淡标（0.04μg/ml）10—

10

—

三氟乙酸1小滴１小滴—

—

（反应5min，热风吹2min，<40℃）

定量操作方法第一点第二点第三点第四点样液

—101520μl淡标

10—

—

—μl0.0004μg（0.04μg/ml）定量操作方法如样点的荧光强度与淡标点的荧光强度一致，则样品中AFTB1含量为0.0004μg如样点的荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不同微升，直至样点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致。高效液相色谱法测定AFTB1样品中的黄曲霉毒素经C18柱分离，用带荧光检测器的高效液相色谱仪检测，以保留时间定性，峰面积或峰高定量。样品提取样品粉碎加少量水氯仿提取无水Na2SO4脱水过滤提取液，待净化样品净化和衍生物反应硅镁型吸附剂1.提取液2.氯仿-正己烷氯仿-甲醇3.丙酮-水洗脱洗脱液水浴蒸干氯仿溶解部分加入正己烷、三氟乙酸静置30min氮气吹干用流动相溶解进高效液相色谱仪高效液相测定参考条件检测器：荧光检测器激发波长：360nm

发射波长：425nm色谱柱：C18流动相：甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾（1+1）或乙腈-甲醇-水（50+150+300）流速：1.3ml/min微柱筛选法P130样液中黄曲霉毒素被微柱管内硅镁型吸附剂层吸附后,在365nm紫外光灯下显示蓝紫色荧光环，其荧光强度与黄曲霉毒素在一定的浓度范围内成正比例关系。由于在微柱上不能分离黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2,所以测得结果为总的黄曲霉毒素含量。

GB/T5009.23-2006玻璃微柱管：内径0.4cm，长12cm,为便于加液可在管的上部接一段粗的管口。

微柱层析架：附有接受洗脱废液的容器，要尽可能密闭。

下层甲醇水提取液花生油振摇石油醚甲醇-水氯仿下层弃去水层，洗去残留甲醇过滤备用无水硫酸钠水黄曲霉毒素的提取—甲醇-水-石油醚提取法下层萃取液玉米磨碎润湿氯仿过滤备用无水硫酸钠黄曲霉毒素的提取—三氯甲烷水提取法甲醇-水微柱管制备脱脂棉（铺顶层）3cm无水硫酸钠（60～100目）1.5cm酸性氧化铝1～2.5cm中性氧化铝0.5cm无水硫酸钠0.5cm硅镁型吸附剂0.5cm无水硫酸钠脱脂棉（作底层）

微柱层析1ml液体样液0.0025μg/ml标液0.005μg/ml标液氯仿展开剂：丙酮－三氯甲烷（1:9）结果观察与评定

365nm紫外光照射若样品柱管内硅镁型吸附剂层只现微黄色荧光环，则样品中黄曲霉毒素含量为未检出(在5或10μg／kg以下)；若出现蓝紫色荧光环，则需进一步通过薄层色谱测定法进行测定。

确证时，不需重新提取样品其操作如下：准确吸取原三氯甲烷提取液于小蒸发皿内挥干，以少量苯－乙腈混合液(98＋2)分数次转入刻度小管中，定容至1.0mL，密塞，混匀，按薄层层析法确证，并测定黄曲霉毒素B1

、B2

、G1、G2

的含量。需要说明之处层析用的氧化铝、硅镁型吸附剂及无水硫酸钠使用前应在120℃活化2h，装瓶盖严于干燥器内，可保存1周左右，超过1周需再次活化层析结束后，最好在2h内观察接受洗脱液的容器要密封第三节赭曲霉毒素A的检验赭曲霉毒素的理化性质由曲霉菌，如赭曲霉、硫色曲霉、蜂蜜曲霉以及绿青霉等产生的一类毒素。赭曲霉毒素A（OTA）毒性最大，在霉变谷物、饲料等最常见。OTA微溶于水、石油醚，加碱成盐，水溶解性增大酸性时，溶于苯、氯仿。对紫外线不稳定，几天即分解（应避光）用三氯甲烷-0.1mol/L磷酸或石油醚-甲醇/水提取样品中的赭曲霉毒素A，样品提取液经液-液分配后，根据其在365nm紫外光灯下产生黄绿色荧光，在薄层色谱板上与标准比较测定含量。采用双相展开法薄层色谱法GB/T5009.96-2003氯仿层样品粉碎过滤氯仿磷酸NaHCO3水层氯仿层蒸干备用苯-乙腈盐酸氯仿提取（甲法）甲醇-水层样品粉碎过滤石油醚甲醇-水氯仿层震荡氯仿层备用苯-乙腈NaCl饱和溶液提取（乙法）氯仿点样、纵展展开剂：无水乙醚乙醚-甲醇-水纵展2～3cm

样品+标液横展展开10～12cm样品+标液

样液与标品展开剂：无水乙醚乙醚-甲醇-水纵展展开剂：甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水甲苯-乙酸乙酯-甲酸苯-冰乙酸纵展13～15cm

样品+标液观察及确证365nm与标准点的相应处有黄绿色荧光确证用碳酸氢钠乙醇溶液喷洒色谱板，室温下干燥紫外灯OTA荧光点应由黄绿色变为蓝色稀释定量比较样液中OA与标准OA点的荧光强度，估计稀释倍数。薄层板经双向展开后，当样品中OA含量高时，OA的荧光点会被横向拉长，使点变扁，或分成两个黄绿色荧光点。在横展过程中，原点上OA的量超过了硅胶的吸附能力，原点上的杂质和残留溶剂在横展中将OA点横向拉长了。稀释定量这时可根据OA黄绿色荧光的总强度与标准荧光强度比较，估计需减少的滴加微升数或所需稀释倍数。经稀释后测定含量时，可在样液点的左边基线上滴加二个标准点，OA的量可为4ng、8ng，比较样液与两个标准OA荧光点的荧光强度，概略定量方法说明本标准规定了谷物和大豆中OTA的薄层色谱测定方法。本标准适用于小麦、玉米和大豆中OTA的测定。薄层板上OTA的最低检出量为4ng。本方法的最低检测量为10μg/kg。标准使用液冰箱黑纸避光第四节展青霉素的检验一、展青霉素的理化性质无色结晶，熔点110℃，在70-100℃可升华；溶于水和乙醇；在碱性条件下不稳定，在酸性溶液中较稳定，耐热。二、食品中的来源主要存在于腐烂水果及其制品中展青霉素由荨麻青霉、扩张青霉和棒曲霉等霉菌代谢产生的。三、毒性与危害四、卫生标准五、分析方法展青霉素的测定方法有气相色谱法、高效液相色谱法和薄层色谱法。我国的标准分析方法为双向薄层扫描定量测定法。双相薄层扫描测定法用乙酸乙酯提取果汁，利用1.5%碳酸钠净化样品，经双向薄层分离后，利用薄层扫描仪进行紫外反射光扫描定量。

本方法适合于苹果、山楂制品及其半成品中展青霉素的测定GB/T5009.185-2003薄层扫描仪展青霉素的提取果汁：加乙酸乙酯，振摇2min，静置分层。重复以上步骤两次，合并有机相。有机相加碳酸钠，振摇1min，静置分层后，弃去碳酸钠层，再用碳酸钠重复处理一次。提取液滤真空减压浓缩近干，用少许三氯甲烷清洗瓶壁，浓缩干，加三氯甲烷定溶，供薄层色谱分析用。展青霉素的提取鲜苹果、果酱：苹果洗净、削皮、打碎置研钵中，加无水硫酸钠研磨后转至锥形瓶加乙酸乙酯浸泡、振荡，过滤滤液减压浓缩近干，用少许三氯甲烷清洗瓶壁，浓缩干，三氯甲烷定溶，供薄层色谱分析用。薄层分析点样标液与样液相差3cm

在样品点用一垂直线上，距顶端2cm处点20ng的标准液，为位置参考点。固定相：硅胶GF254

薄层分析双向展开先横向，排除杂质的干扰，再纵向在波长254nm紫外灯下观察，展青霉素Rf值约为0.35，若样品点出现黑点，则样品为阳性。根据样液黑色吸收点的强度高低，稀释不同倍数后，再点样10μL，使每个样品点展青霉素的绝对量在10~100ng之间，经双向展开后，进行扫描定量测定。

确证阳性样品的验证：将阳性样品的薄层色谱板喷以MBTH显色剂，130℃烘烤15min，冷却至室温后，于波长360nm紫外灯下观察，展青霉素应呈橙黄色点。定量测定波长270nm；参考波长310nm；反射光测定；扫描速度40nn/min；记录仪纸速20nn/min；根据标准及样品中展青霉素峰面积，按下式计算样品中展青霉素含量。

X——果汁中展青霉素含量，μg/mL；

Y——鲜苹果中展青霉素含，μg/g；

c——展青霉素标准液浓度，μg/mL；

A——样液展青霉素峰面积；YS——展青霉素标准峰面积；

V——加三氯甲烷定容体积，mL；

D——样液点稀释倍数；

m——样品质量，g；

V1——液体样品的体积，mL。第五节脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的检验脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）三羟基-12,13环氧单端孢霉-9烯-8酮可溶于水、含水甲醇、含水乙醇、乙酸乙酯等紫外光下无荧光雪腐镰刀菌烯醇（NIV）四羟基-12,13环氧单端孢霉-9烯-8酮易溶于水、甲醇、乙醇等极性比DON大也称呕吐毒素分子结构毒性与危害卫生标准主要来源：DON及NIV主要是雪腐镰刀菌污染小麦、玉米、豆饼等粮食和饲料产生的代谢产物。分析方法：我国规定DON的标准分析方法是薄层色谱法（第一法）和免疫测定法（第二法）。其他常用的方法有GC,HPLC及微柱法。脱氧雪腐镰刀菌烯醇-薄层色谱法测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇经提取、净化、浓缩和硅胶G薄层展开后，加热薄层板。由于在制备薄层板时加入了三氯化铝，使脱氧雪腐镰刀菌烯醇在365nm紫外光灯下显蓝色荧光，与标准比较。

本标准适合于谷物及其制品GB/T5009.111-2003提取粉碎样品加水、三氯甲烷-无水乙醇振荡1h过滤滤液蒸干液液分配净化石油醚溶解残渣再用甲醇-水分次洗涤蒸发皿甲醇-水层过中性氧化铝、活性炭柱甲醇-水淋洗柱子沸水浴浓缩至干乙酸乙酯溶解，浓缩，备用点样、展开、测定先点样液横展：使DON偏离原点（杂质）展开剂：乙醚-丙酮或无水乙醚

对于小麦制品，还须再用10mL石油醚横展一次。加点标准液后纵展开展开剂：三氯甲烷-丙酮-异丙醇(8:1:1)

三氯甲烷-丙酮-异丙醇-水(7.5:1:1.5:0.1)薄层上端与样品点相对应的位置点一个DON标准点，作为定位参考观察365nm杂质有荧光DON无荧光而后薄层板在130℃加热，冷却后如DON处无荧光，则为阴性杂质、DON均有荧光，但是刚好分开，为阳性定量阳性样品与不同量的标准点一起进行薄层色谱分析，比较样品与各标准点DON点荧光强度，进行概略定量。

薄层色谱法（DON，NIV）