第3章凯氏定氮法

第3章

发酵原料中粗蛋白质的测定

发酵原料中粗蛋白质的测定教学重点:掌握方法的原理、测定步骤；掌握消化．蒸馏、滴定操作技术;学会使用凯氏定氮仪.教学难点:消化．蒸馏、滴定操作技术及测定过程的注意事项。CompanyLogo发酵原料中粗蛋白质的测定一、目的和意义食物中蛋白质含量是了解人体蛋白质摄入量的基础资料。蛋白质含量的高低对产品质量影响重大，是评价原料及成品质量的重要指标之一。CompanyLogo发酵原料中粗蛋白质的测定一类：利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；蛋白质的测定方法另一类：利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。CompanyLogo5.红外检测仪4.酚试剂法2.双缩脲分光光度比色法凯氏定氮法蛋白质的测定方法3.染料结合分光光度比色法CompanyLogo发酵原料中粗蛋白质的测定一般食品蛋白质含氮量为10％左右，动植物原料中蛋白质的含氮量一般为15%~17.6%，有的上下浮动,可以测出总氮：蛋白质含量=N/16%=N×6.25肉、蛋、豌豆、玉米等，其换算系数为6.25，小麦取5.70，大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17，动物胶5.55。含有的元素：C、H、O、NCompanyLogo加碱NaOH蒸馏，使NH3游离样品与浓硫酸和催化剂共热消化，使蛋白质分解有机氮转化为NH3，并与H2SO4结合成（NH4)2SO4；再用标准盐酸接s收，过量酸用标准NaOH滴定。或者用硼酸吸收形成硼酸铵，再以标准盐酸滴定，根据标准盐酸消耗量可计算出粗蛋白质的含量。常量凯氏定氮法消化蒸馏滴定一、原理CompanyLogo（1）浓H2S04使试样中的有机物脱水炭化、氧化。浓H2S04在338℃分解产生氧气、破坏有机物，生成CO2和

H2O2。

2H2S04=2S02+2H2O+O2C+O2=CO2

2H2+O2=2H2O蛋白质

RCH（NH2）COOH

NH3+CO2+SO2+H2O2NH3+H2S04

（过量）

（

NH4）2S04在消化过程中，反应生成的（NH4）2S04留在溶液中，其他的产物CO2、SO2及H2O都挥发逸出。浓H2S04浓H2S04常量凯氏定氮法CompanyLogo（2）CuSO4作为催化剂，加快反应速度。

2CuSO4=Cu2SO4+SO2+2[O]2CuSO4+C=Cu2SO4+SO2+2CO2Cu2SO4+2H2S04=2CuSO4+2H2O+SO2此反应反复循环地进行，反应中产生的新生态氧使有机物加快降解。（3）K2SO4使反应液沸点提高，可达400℃。

K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+SO3+H2O（4）H2O2可加速有机物分解。

H2O2+2H+=2H2OE0=1.77VO2+4H+=2H2OE0=10299V常量凯氏定氮法CompanyLogo（5）30%NaOH溶液使消化液中的NH3通过蒸馏游离出来。（NH4）S04+2NaOH=Na2SO4+2H2O+2NH3蒸馏出来的NH3被H3BO3吸收：

2NH3+4H3BO3=（NH4）B4O7+5H2O(6)生成的（NH4）B4O7用HCl滴定：（NH4）B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3试样中的总氮（粗蛋白）=蛋白质中的氮+氨基酸、酰胺、核酸等中的氮常量凯氏定氮法CompanyLogo二、试剂与器材1、消化液：H2O2：H2S04：H2O=3：2：12、粉末硫酸钾―硫酸铜混合物

K2S04与CuS04.5H20以3：1混合3、30％氢氧化钠溶液4、2％硼酸溶液5、标准盐酸溶液(约0.01mol／L)6、混合指示剂(田氏指示剂)

由50mL0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL0.1％甲基红乙醇溶液混合配成，棕色瓶贮存。酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。7、待测样品1.凯氏烧瓶2.凯氏定氮仪3.分析天平4.酸式滴定管5.烘箱6.消化炉7.容量瓶等等CompanyLogo三、操作方法结果计算滴定接收蒸馏消化CompanyLogo三、操作方法1.消化前样品处理

固体样品105℃烘干至恒重。若样品为液体(如血清等)，可取一定体积样品直接消化测定。？CompanyLogo2、消化取凯氏烧瓶标号。各加几颗玻璃珠;1及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂200mg，消化液5mL。3及4号瓶中各加相同量的催化剂和消化液-----对照，以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。

1、加样时应直接送人瓶底，不要沾在瓶口和瓶颈上。2、火力控制，先小后大。3、消化完全。注意事项CompanyLogo（2）蒸馏

3、蒸馏吸收CompanyLogo

3、蒸馏吸收特点：将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，操作简便。

1)水蒸汽发生器和反应室2)冷凝器和通气室3)排水柱关键：搞清水管系统CompanyLogo3、蒸馏吸收1、消化液加蒸馏水稀释后,应及时蒸馏,2、蒸馏时，加入氢氧化钠要过量，溶液应呈褐色,若是呈蓝色,则说明碱不够.

并且动作还要迅速以防止氨的流失3、蒸气发生瓶内的水装至三分之二体积并且保持酸性以防止在碱性条件水中游离氨蒸出,使结果偏大。4、蒸馏时蒸气要发生均匀,充足,蒸馏中不得停火断气,否则会发生倒吸。5、停止蒸馏时防止倒吸,应先将冷凝管下端提高液面并清洗管口,再蒸1min后关掉热源。6、蒸馏是否完全,可用精密pH试纸测冷凝管口的冷凝液来测定,中性则说明已蒸馏完全。注意事项CompanyLogo4、滴定全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。使用前检查酸式滴定管漏不漏？漏的话，涂凡士林。滴定时一边滴一边摇，防止滴定过头！及时记录读数要求：空白液1次，样品消化液2次注意事项CompanyLogo5、计算总氮量(％)

=c为标准盐酸溶液摩尔浓度(0.0098M)；V1为滴定样品消化液用去的盐酸溶液平均mL数；V2为滴定空白液用去的盐酸溶液mL数；w为样品重量(1g)。14为氮的相对量子质量。

消化液总量500ml,蒸馏时消化液用量3ml样品蛋