高效液相色谱-03

第七章

液相色谱分析法一、液相色谱固定相stationaryphaseofHPLC二、液相色谱流动相

mobilephaseofHPLC第三节

液相色谱的固定相与流动相highperformanceliquidchromatographstationaryphaseandmobilephaseofHPLC2023/2/5一、液相色谱固定相

stationaryphasesofLC（一）.液-液分配及离子对分离固定相（1）全多孔型担体

由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）

30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；2023/2/5（3）化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳键型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—C

稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；

c.硅碳键型：≡Si—C

d.硅氮键型：≡Si—N2023/2/5用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体(硅胶)表面上，所形成的固定相，称为化学键合相。具有分配和吸附作用。优点：①使用过程不易流失；②化学性质稳定，在pH2~8的溶液不变质；③热稳定性好，一般在70℃以下稳定；④载样量大，比硅胶高约一个数量级；⑤适于作梯度洗脱。化学键合相2023/2/5化学键合相一般用硅胶作载体，具有分配作用和一定的吸附作用。吸附作用的大小视键合覆盖率而定。用化学反应方法将载体表面上残存的硅醇基除去，称为封尾(封顶或遮盖)，所形成的键合相称为封尾键合相，完全封尾的键合相无吸附作用，缺点是疏水强。按极性分类：非极性、中等极性、极性键合相3类化学键合相2023/2/5化学键合相1.非极性键合相：十八烷基硅烷键合相(ODS)是最常用的非极性键合相。2.中等极性键合相：常见的有醚基键合相。3.极性键合相：强极性－氨基键合相(分析糖类)；中强极性－氰基键合相。2023/2/5（二）.液-固吸附分离固定相

种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：5～10μm；

2023/2/51.硅胶

⑴无定形多孔硅胶，国产代号YWG，dp5~10μm⑵球形全多孔硅胶，国产代号YQG，dp3~10μm⑶堆积硅珠，国产代号YQG，dp3~5μm2.氧化铝⑴球形(5～10μm)；⑵无定形(5～10μm)。3.高分子微孔多球(有机胶)

⑴国产YSG系列；⑵日立3010胶等。4.其它

⑴分子筛；⑵聚酰胺等。液－固色谱固定相2023/2/5（三）.离子交换色谱分离固定相结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）

树脂类别：（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）2023/2/5（四）.空间排阻分离固定相（1）软质凝胶葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。2023/2/5(五)色谱柱-结构色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。色谱填料：经过制备处理后，用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是5-10粒径的球形颗粒。色谱柱管：内部抛光的不锈钢管。典型的液相色谱分析柱尺寸是内径4.6mm，长250mm。色谱柱：也称固定相，是将色谱填料填充到色谱柱管中所构成的,其结构如图所示。2023/2/5(五)色谱柱-色谱柱装填干法填充：在硬台面上铺上软垫，将空柱管上端打开垂直放在软垫上，用漏斗每次灌入50-100mg填料，然后垂直台面墩10-20次。湿法填充：又称淤浆填充法，使用专门的填充装置（图8-9）。2023/2/5(五)色谱柱-使用和维护 色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。 ①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。

②一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则 反冲会迅速降低柱效。 ③选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。 ④避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。

⑤保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。 ⑥色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。2023/2/5(五)色谱柱-填料的结构色谱填料是由基质和功能层两部分构成。基质：又常称作载体或担体，通常制备成数微米至数十微米粒径的球形颗粒，它具有一定的刚性，能承受一定的压力，对分离不起明显的作用，只是作为功能基团的载体。常用来作基质的有硅胶和有机高分子聚合物微球。功能层：是通过化学或物理的方法固定在基质表面的、对样品分子的保留起实质作用的有机分子或功能团。如图8-10是硅胶基质的冠醚大分子固定相的结构示意图，功能层冠醚分子吸附或键合在硅胶基质的表面。2023/2/5(五)色谱柱-填料的结构4.26填料的物理结构：分为微孔型（或凝胶型）、大孔型（全多孔型）、薄壳型和表面多孔型四种类型，如图8-11所示。2023/2/5二、液相色谱的流动相

mobilephasesofLC1.流动相特性

（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。2023/2/52.流动相类别

按流动相组成分：单组分和多组分；

按极性分：极性、弱极性、非极性；

按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。

常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2023/2/53.流动相的选择

①样品易溶，且溶解度尽可能大。②化学性质稳定，不损坏柱子。③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。④粘度低，流动性好。⑤易于从其中回收样品。⑥无毒或低毒，易于操作。⑦易于制成高纯度，即色谱纯。⑧废液易处理，不污染环境。2023/2/53.流动相选择

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。

常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)2023/2/54.选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。2023/2/55分离方程式依据分离方程式讨论溶剂系统对分离度的影响分离度受三项因素左右：a项由色谱柱的质量决定；b、c两项由流动相决定。相对保留值r与容量因子k虽然相互关联，但溶剂的种类主要改变r。这是因为溶剂的种类不同，分子间的作用力的性质、强度不同，选择性不同。在溶剂种类确定以后，配比的调整只是改变极性，改变洗脱能力，改变保留时间，而分子间作用力的性质不变，因此主要是改变容量因子k。概括为：溶剂种类主要影响相对保留值r(主要改变峰间距)，溶剂配比主要影响容量因子k(主要改变保留时间)。2023/2/5组分的分配系数，由样品组分、溶剂、固定相三者间的作用力(分子间作用力)综合作用所决定(表7-2)Snyder选用了乙醇、二氧六环、硝基甲苯3个参考物，用于检验3种分子间作用力，分别用Xe、Xd、Xn表述。测定、计算出溶剂的极性参数P′值列于表7－3。P′值大者，极性大，洗脱能力大。表7-2参考物与被检溶剂的作用力关系参考物乙醇(质子给予体)二氧六环(质子受体)硝基甲烷(强偶极)被检溶剂的作用力类型质子受体作用力(Xe)质子给予作用力(Xd)强偶极作用力(Xn)6Snyder溶剂分类2023/2/5表7-3常用溶剂的极性参数与分子间作用力溶剂

P′XeXdXn苯2.70.230.320.45乙醚2.80.530.130.34二氯甲烷3.10.290.180.53正丙烷4.00.530.210.26四氢呋喃4.00.380.200.42氯仿4.10.250.410.33乙醇4.30.520.190.29乙酸乙酯4.40.340.230.43丙酮5.10.350.230.42甲醇5.10.480.220.31乙腈5.80.310.270.42乙酸6.00.390.310.30水10.20.370.370.252023/2/51.正相洗脱用极性小于固定相的流动相的洗脱方式，称为正相洗脱、正相展开。适用于正相色谱法。例如，水、正己烷、正戊烷的值分别为10.2、0.1、0.0，作正相洗脱时，水洗脱能力最强，正己烷和正戊烷的洗脱能力最弱。2.反相洗脱与正相洗脱相反6正相洗脱与反相洗脱2023/2/51.等度洗脱(isocraticelution)用恒定配比的溶剂系统的洗脱方式，称为等度洗脱优点：简便、重复性好、色谱柱易再生。缺点：对于成分复杂的样品，效果欠佳。2.梯度洗脱(gradientelution)梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值、离子强度相应地变化，达到提高分离效果、缩短分析时间的目的。7洗脱方式2023/2/57洗脱方式梯度洗脱的实质：是通过不断地变化流动相的浓度配比，来调整混合样品中各组分的K值，使所有谱带都以最佳平均K值通过色谱柱。比较梯度洗脱与程序升温：在梯度洗脱中溶质K值的变化是通过溶剂的极性、pH值和离子强度来实现的，用于分离组分性质差别较大的复杂样品；而程序升温是借改变温度来影响溶质的K值，用于分离宽沸程的混合样品。优点：①缩短分析周期；②提高分离效果；③改善峰形，很少拖尾；④增加检测灵敏度。2023/2/5高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。流动相溶剂的选择将直接影响组分的分离度.1.基本要求⑴溶剂必须具有合适的极性和良好的选择性(相对于待测样品)，参阅Snyder溶剂分类；⑵溶剂要与检测器匹配，对于紫外吸收检测器，应注意选用检测波长比溶剂的紫外截止波长要长；溶剂名称紫外截止波长/nm正己烷190二硫化碳380四氯化碳265苯210氯仿245二氯甲烷233四氢呋喃212丙酮330乙腈190甲醇205水1878流动相溶剂的选择2023/2/58流动相溶剂的选择⑶高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50～100nm。⑷化学稳定性好。不与样品