第二章 工业微生物4

（五）分子育种1.过量表达（overexpression)目的：（1）直接生产酶（2）强化代谢途径方法：（1）游离载体，自主复制，拷贝数高，不稳定（2）整合型载体，整合到染色体，稳定，整合如何做到高拷贝？重复顺序，核糖体RNA基因(rDNA)、转座子。2.基因敲除（knockout）（基因缺失，破坏）（1）基因功能分析（2）菌种选育3.基因定点突变（site-directedmutation)

（1）替换（2）插入（3）缺失4.Knockin;knockoutandknockin定点突变5.基因的直接进化(directedevolution)突变

易错PCR（errorpronePCR

），正突变库的建立重组

DNAshuffling

，将多个正突变集合到一起筛选

highthrough-put，基因突变库的筛选

步骤：

在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。易错PCRXXXX

XXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXXXXXXXXXXXXXXX

FragmentReassembleSelectbestwithDNAseIfragmentsrecombinantsRepeatformultiplecyclesDNAshufflingDNAShuffling:指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(SexualRecombination)。项目进化速度进化对象进化周期影响对象突变效率常规定向进化缓慢进化整个基因组多年完整基因组低DNAShuffling快速进化特定基因/操纵子/病毒几天部分基因组高DNAShuffling与常规定向进化的比较类型示例特性活性增加倍数潜在应用领域抗体人源抗体亲和性400生物制药酶天冬氨酸转氨酶催化特异性10，000生物制药β-内酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草杆菌蛋白酶E耐热性65℃耐热时间17200工业酶细胞因子人类干扰素抗病毒285，000基因治疗肿瘤抑制因子P5337℃半衰期12基因治疗代谢途径砷酸盐代谢途径砷酸盐解毒40生物制药汞代谢途径汞解毒12生物制药部分DNAShuffling技术的研究成果脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯例：PLAPLA光学拆分选择性(%)231577581905次错位PCR2次定点突变Reetz(1997)Liebeton(2000)6.基因组重排（genomeshuffling）多亲株多轮原生质体融合筛选的有效性二、微生物代谢工程的进展遗传修饰设计策略代谢分析出发菌株高效生产菌株代谢工程的基本思路

设计策略是基础遗传修饰是关键设计策略：正向(Constructive)代谢工程

1991年在Science上正式提出，基本思想是：根据已有的遗传和生化知识，找出限速步骤，进行遗传操作正向代谢工程：重新分配中心途径代谢流PyruvateLactateSugarldhNADHNAD+XNADHNAD+L-alaninealadfromBacillusNH4+AlanineracemaseX乳酸乳球菌以同型发酵方式，将95%以上的葡萄糖转化为L-乳酸将乳酸脱氢酶（LDH）敲除，然后再表达丙氨酸脱氢酶，并敲除丙氨酸消旋酶，可以将原来到L-乳酸的碳流重新分配到L-丙氨酸（甜味剂）实现同型乳酸发酵到同型丙氨酸发酵。设计策略：反向(Inverse)代谢工程1996年首次提出，三个步骤：1.获得预期的表型2.确定其基因型3.选择工业菌株并对其相应基因进行遗传操作，以期获得同样的表型反向代谢工程：基因组测序发现新靶点日本学者对两株谷氨酸棒杆菌（一株是生长较差但能高产赖氨酸的突变株、另一株为生长良好的野生型）进行全基因组测序找出突变株与野生型不同、且有可能影响赖氨酸生产的突变基因然后将这些突变导入野生型，结果获得了迄今为止最高水平的赖氨酸生产率3gL-1h-1这是利用组学进行反向代谢工程研究的第一个例子设计策略：进化(Evolutionary)代谢工程

基因组重排于2002年正式提出引发NatureBiotechnol.评论进化代谢工程：泰乐菌素菌种改良自然适应和进化代谢工程遗传修饰：基因敲除DNAGene1Gene2Gene3Enzyme1Enzyme2Enzyme3ABCDADNAXXX遗传修饰：基因表达DNAGene1Gene2Gene3Enzyme1Enzyme2Enzyme3ABCDADNAXXXGene4Enzyme4E代谢分析：代谢网络模型和代谢组学JochenForsteretal.GenomeRes.2003;13:244-253代谢分析：代谢通量分析E’??????A?C?EABCDEv1v2v3v4v5v6v7ABCDEMetaboliteidentificationPathwayreconstructionMetabolicfluxanalysisv1?v3??v6v7其基本原理是假设胞内代谢物浓度都处于拟稳态，根据物质平衡得到一系列关于通量的数学方程，然后通过测定其中一些通量的变化，来获得整个代谢网络的通量分布[5]。MFA已在许多微生物的代谢工程中得到应用。代谢分析：互相作用关系综合设计策略：1,3-丙二醇3-磷酸甘油醛丙酮酸葡萄糖TCA循环磷酸二羟丙酮3-磷酸甘油甘油酵母的甘油途径大肠杆菌自身的代谢途径1,3-丙二醇3-羟基丙醛肺炎杆菌的1,3-丙二醇途径

修饰了>70个基因，最后工程菌中有18个基因被敲除或过量表达

1,3-丙二醇产量135g/L，生产率3.5g/L，h1A（1）B（2）2A（1）B（2）C（3）通用转录机器工程第三节工业生产菌种的复壮与保藏一、退化现象及原因二、复壮三、菌种的保藏一、工业生产菌种的退化现象及原因什么是菌种退化?表现：产量性状及与产量性状相关的形态上和生理上的变化抗不良条件能力的下降，如抗噬菌体，耐温性能等量变到质变的逐渐演化过程（一）菌种退化的原因基因突变（回复突变）分离现象Letter:Genome-widenon-mendelianinheritanceofextra-genomicinformationinArabidopsisSusanJ.Lolle,JenniferL.Victor,JessicaM.YoungandRobertE.Pruittdoi:10.1038/nature03380回复突变（二）菌种退化的防治1.菌种选育方面：使用孢子或单核菌株，避免对多核菌株进行处理较高的诱变剂量，减少回复突变充分的中间培养及分离纯化2.控制传代次数3.创造良好的培养条件4.利用不易衰退的细胞传代，孢子5.有效的菌种保藏方法传代次数每代斜面保存时间/d回复子比例

腺苷产量/(g/L)1（147）1/4.5×10613.22（133）（14）1/2.4×10614.96（47）（3）（9）（3）（71）（14）1/2.2×10510.77（47）（3）（9）（3）（13）（58）（14）1/3.5×10613.19（47）（3）（9）（3）（13）（8）（3）（47）（14）1/5.3×1038.112(47)（3）（9）（3）（13）（8）（3）（4）（14）（6）（6）（31）1/1.0×1037.4二、生产菌种的复壮纯种分离淘汰已衰退的个体选择合适的培养条件三、工业生产菌种的保藏保藏的意义：存活健在避免退化，保证高产稳产保证研究结果良好的重现性基本措施降低营养成分，低温，干燥，缺氧等条件，使其处于生长停滞或休眠状态常用保藏方法斜面保藏和穿刺保藏（好气性）沙土管干燥保藏产孢子的丝状真菌或放线菌，或产芽孢的细菌真空冷冻干燥保藏方法安瓿管的处理保护剂的使用，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。低温保藏普通冷冻保藏技术(-20℃)超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)液氮冷冻保藏技术保护剂的的使用，甘油，二甲基亚砜不同保藏方法的比较菌种保藏的注意事项菌种在保藏前所处的状态菌种保藏所用的基质操作过程对细胞结构的损害国内外菌种保藏机构国外：ATCC（AmericanTypeCultureCollection）

ATCCisaglobalbioresourcecenterthatstoresanddistributesbiologicalmaterialssuchascelllines,bacteria,animalandplantvirusesandantisera,fungi,protozoa,algae,clonesandothermoleculargenomicmaterialsATCC(AmericanTypeCultureCollection）美国典型菌种保藏中心

ATCC主要从事农业、遗传学、应用微生物、免疫学、细胞生物学、工业微生物学、菌种保藏方法、医学微生物学、分子生物学、植物病理学、普通微生物学、分类学、食品科学等的研究。

该中心保藏有藻类111株，细菌和抗生素16865株，细胞和杂合细胞4300株，丝状真菌和酵母46000株，植物组织79株，种子600株，原生动物1800株，动物病毒、衣原体和病原体2189株，植物病毒1563种。

另外，该中心还提供菌种的分离、鉴定及保藏服务。该中心保藏的菌种可出售。ARSCultureCollection-NRRL/WelcometothenewARS(NRRL)CultureCollectionwebsite.TheCollectionishousedwithintheMicrobialGenomicsandBioprocessingResearchUnitattheNationalCenterforAgriculturalUtilizationResearch(NCAUR)inPeoria,Illinois.ThiswebsitecontainsinformationspecifictotheARSCultureCollection,butadditionalinformationregardingtheResearchUnitandNCAUR---NorthernRegionalResearchLaboratoryAgriculturalResearchServiceCultureCollection

NationalCenterforAgriculturalUtilizationResearch

Peoria,IllinoisUSANRRL(AgriculturalResearchServiceCultureCollection)美国农业研究菌种保藏中心

NRRL是由美国农业部农业研究中心支持的政府性质的菌种保藏中心。主要从事农业、应用微生物、基因工程、工业微生物、菌种保藏方法、环境保护、分子生物学、食品安全、普通微生物、分类学的研究。

该中心保藏有细菌10500株，真菌45000株，酵母14500株，放线菌9500株。

另外，该中心还提供细菌、真菌、酵母的鉴定服务。

CBS(CentraalbureauvoorSchimmelcultures)荷兰微生物菌种保藏中心网址：www.cbs.knaw.nl/.CBS是半政府性质的主要保藏真菌、酵母菌种保藏中心。

该中心主要从事菌种保藏方法、分类学、分子生物学、医学微生物学等的研究。

该中心保藏有真菌35000株、酵母5500株。该中心保藏的菌种可出售。NBRC33023

AspergillusnigervanTieghemSynonym:Aspergilluscinnamomeus,Aspergillusnigervar.altipes,Aspergillusschiemanni

←IFO33023←CBS554.65

=ATCC16888=BCRC31130=CBS554.65=IAM15058=IMI50566=IMI50566ii=JCM10254=JCM1864=NRRL326=RIB2641

Source:tannin-gallicacidf