第11章 基因工程新技术

第11章基因工程新技术1.λRed和RecET重组系统及其应用

2.位点特异性重组系统及其应用

3.基因打靶

4.基因抑制技术

早在1990s,研究者发现在酿酒酵母等真菌中具有高效的同源重组系统，仅需要20~40bp长的同源区即可发生重组。可以方便的利用PCR产物进行基因打靶或替换。细菌的同源重组频率较低，且需要较长的同源区段.1.λRed和RecET重组系统及其应用E.coli

自身的同源重组系统主要包括：RecBCD,RecE,RecF系统，其重组效率均较低，且对同源区要求为：1–2kb。最主要的重组系统RecBCD在

dsDNA同源区为50–100kb(通过接合转移和转导)

，才能高效重组。经修饰过的RecBCD及RecA系统能在Chi位点(crossoverhotspotinstigator,GCTGGTGG)高效重组，同源区段长度一般不低于5kb，重组需要DNA片段两端有同向的CHI位点。如果人工构建这样的片段，其重组几率为10-51998年左右，随着对λ噬菌体重组系统的深入研究，发现该重组系统可以在E.coli中实现高效同源重组，且同源区长度要求极低：约40bp。后来，在Rac噬菌体中发现类似的重组系统。随着该技术的应用，出现了一个新的术语：Recombineering(recombination-mediatedgeneticengineering)isageneticandmolecularbiologytechniquebasedonhomologousrecombinationsystemsinE.coliandotherbacteriamediatedbyphageproteins,eitherRecE/TfromRacprophageorRedalpha/beta/gammafrombacteriophagelambdaλRed/ETrecombinationsystemsarehighlightedbytheirabilitytocrossPCR-generatedsubstratesbearingsmallregionsofhomologytothetargetgene(40–50bp)intobacterialchromosomes,allowingbacterialgeneticiststoperformPCR-mediatedgenereplacement(1)λRed系统

及rac噬菌体的RecET系统的原理Red系统包括3个基因:exo,bet

和gamexo

基因编码λ核酸外切酶，其活性形式是一种环状三聚物分子,中间有一中空的通道,通道的一端可容纳双链DNA分子,另一端只可容纳单链DNA。Exo蛋白可结合在双链DNA的末端,从DNA双链的5′端向3′端降解DNA,产生3′突出端。(RecE)Beta蛋白是一种退火蛋白,自发地形成环状结构(12–18subunitsperring),,紧紧地结合在单链DNA3′突出端,防止DNA被单链核酸酶降解,同时介导互补单链DNA的退火,双链DNA退火完成后,Beta蛋白从DNA双链上解离下来。Beta蛋白在Red同源重组过程中起着决定性的作(RecT)

Gam蛋白可与RecBCD结合,抑制其核酸外切酶活性，防止对外源DNA的降解。宿主菌用recBCD缺陷株有利于该系统的高效重组。λRed系统的重组效率约比RecET系统高3倍。★(2)主要应用需要辅助质粒，上面带有诱导表达的重组系统。为避免本底表达对细胞的影响（毒性、诱变等效应），辅助质粒多为温敏性质粒，可在高温下被消除。PCR产物扩增诱导培养含pKD46大肠杆菌转化PCR片段，培养2h后涂布抗性平板，高温培养I基因敲除及markerfree操作（需结合位点特异性重组技术）II结合反向筛选进行基因替换正向筛选：含有标记基因的克隆在筛选平板上长出，不含标记基因则死亡。反向筛选：也称为负筛选，含有标记基因的克隆死亡，不含标记基因的克隆正常生长catsacBgeneAgeneAMutantcatsacBcatsacBgeneAMutantStep1Step2例：cat正筛选标记，sacB负筛选标记chloramphenicolMediumsucrose重叠延伸PCR基因敲除catsacBgeneAgeneAcatsacBcatsacBgeneAStep1Step2Geneinversion（smallfragment)III介导单链DAN重组，进行基因修饰如果向细胞中导入ssDNA(DNAoligo),则不需要Exo蛋白就能够与同源区退火，实际上，Bet单独作用可以使70-basessDNAoligo(SSO)与染色体的同源区退火互补而发生重组，其频率约2×105/108,比dsDNA略高。如果存在Gam蛋白，则重组效率可提高(5-fold）.40–60bp单链的重组效率下降5倍。另外，和滞后链重组的效率高于前导链。由于不能插入标记基因，使得其只能应用于具有明显表型特征的基因修饰。

改进：

MMR(specifcallyremovetheoligo-directedbasechange)系统缺陷株中，重组效率会提高2个数量级，可高达25%！这意味着不再需要标记基因，可以进行数个碱基的替换、插入或缺失。mutS:Methyl-directedMismatchRepair重大改进：MAGE技术（MultiplexAutomatedGenomeEngineering）1.多种ssDNA并行重组，同时进行多位点修饰。2.多轮循环重组，提高多位点修饰的几率3.适于高通量的随机优化缺点：对于多位点随机优化，需要高通量筛选技术，或具有明显的表型特征只能进行短序列的修饰（如RBS位点）ProgrammingcellsbymultiplexgenomeengineeringandacceleratedevolutionNature

460,894-898markermarker2IV染色体大片段复制

复制染色体上的基因：加入PCR产物，引物设计时上游引物与目标基因下游序列同源，下游引物与目标基因上游序列同源，第一次重组造成染色体断裂，第二次重组一条染色体修复，并造成目标基因多一个拷贝。

引物设计时加入同向排列的特异性位点，可弹出MARKER

应用该技术可复制长达1Mbp的序列。2.位点特异性重组系统及其应用位点特异性重组重组发生在特殊位点上，此位点含有短的同源序列,供重组蛋白识别。

位点特异性重组与同源重组的区别

重组位点限制：有同源序列的长短：短重组酶的专一性：有重组效率：高达100%常见的位点特异性重组系统

λ噬菌体系统：λ噬菌体编码λ整合酶（integrase，Int重组酶，不可逆）、来自E.coli的整合作用宿主因子（IHF，integrationhostfactor）、切除酶（excisionase）

P1噬菌体系统:Cre重组酶（可逆）

2m质粒系统：FLP重组酶（可逆）

链霉菌噬菌体C31系统（不可逆）均可广泛应用于真核细胞中两边为13bp反向重复序列，中间位8bp非对称核心序列（1）重组机理如果一个DNA分子上两个特异位点之间发生重组，其后果有两种可能性：两个位点之间的片段或丢失，或被颠倒生物能够利用这种重组倒置来控制基因的表达因为DNA的一正一倒两种排列法可以相应地表达两种不同的蛋白质，细胞就可根据需要作出选择。Cre重组酶催化位点：loxP位点loxPloxPloxPloxP当基因组含有一个重组酶识别位点时，转入基因可以发生位点特异性整合，但必须解决整合的稳定性问题loxp位点的点突变Cre酶无法有效识别降低基因丢失几率：突变点loxp位点的点突变Cre酶无法有效识别实现稳定的基因颠倒：突变点或者采用类似于λred系统的策略，重组酶基因在温敏性辅助质粒上诱导表达（2）主要应用

I利用位点特异性重组控制转入基因的表达将一个序列置于目标基因与其启动子之间（如转录终止单元＋loxP序列）阻遏基因的表达将cre基因置于诱导启动子控制之下，控制Cre重组酶的表达，从而控制目标基因的表达loxPloxPII条件缺失突变体的构建在目标基因的两侧引入特异性重组位点将cre基因置于诱导启动子或具有组织特异性的启动子控制之下，在某种条件下使Cre重组酶表达，从而缺失目标基因优点：同源重组造成“完全的”基因敲除，而同源重组和位点特异性重组结合后可以对基因敲除进行时间和空间上的控制，例如可以研究致死型基因在特殊发育阶段的效应、研究基因是否在某种组织中表达。要避免Cre重组酶的背景活性III利用位点特异性重组进行染色体工程markermarkermarker1marker2FRT/loxPFRT/loxPFRT/loxPFRT/loxPFRT/loxPFRT/loxP位点特异性重组大肠杆菌中采用该方式一次性删除117-165-kbp片段，效率100%Markerfree操作，但不属于无痕操作，每次重组留下一个疤痕，造成极性效应，多影响下游基因表达。多个疤痕对后续操作也有不利影响例：植物中染色体大片段的缺失gusA：编码β-葡(萄)糖苷酸酶，报告基因Ds:植物转座子

染色体大片段颠倒：两个特异性位点反向排列，重组酶表达后，部分细胞的两个位点之间序列颠倒。FRT/loxPFRT/loxPmarker1marker2marker1marker2基因融合tagsequenceloxP/FRTsequencegeneACterminalsequence(notranslationstopsignal)markergeneAmarkermolecularcloningfreeAsinglechromosomalFRTsitebecomesthesubstrateforrecombinationwithFRT-containingreplication-deficientplasmidsthatcarrieslacZandlacY,designedinsuchawaytocreateeitheratranscriptionalortranslationalfusiontothepromoterofinterest.3.基因打靶及无痕操作技术基因打靶：利用外源DNA与染色体DNA的同源性进行同源重组，从而定点修饰改造染色体DNA的一类技术。（1）主要方法单交换同源重组双交换同源重组二次单交换同源重组（属于无痕操作技术）其它无痕操纵技术I单交换同源重组法

利用整合性质粒上与染色体DNA同源的区段进行同源重组，通过整合性质粒插入染色体来达到对染色体DNA的复制、失活、启动子替换等目的。原理图：启动子+完整orfA:复制orfA的5’端或中间区域：失活orfA的3‘端区域：对基因A表达无影响，在染色体上多了一个不完整的orfA拷贝（缺5’端）诱导启动子+5‘端：实现A基因的启动子替换、构建条件敲除株构建整合质粒：原启动子+orfA5’端与报告基因的融合片段（转录融合、翻译融合均可）可以通过报告基因研究原启动子的表达规律，即基因A的表达规律对于高效短同源重组系统，可用两端有短同源区的PCR产物直接进行基因打靶（见red系统），省去克隆步骤。对于长同源区重组系统，无法通过PCR引物引入同源区，需要经过多次克隆构建基因打靶质粒，然后转化质粒进行基因打靶II双交换同源重组Marker2Marker2可实现基因敲除(B)及基因的异位整合表达(A)orfB白喉毒素A基因（DTPA)的负筛选作用：A亚基抑制蛋白合成，不需加筛选药物，从而避免真核细胞的非同源重组整合neo基因的正筛选作用，对氨基糖苷类抗生素G418的抗性单纯疱疹病毒胸苷激酶

(HSVTK)基因的负筛选作用，将丙氧鸟苷或非阿尿苷（FIAU）变为毒性物质，在含丙氧鸟苷或FIAU培养基中筛选基因寻靶质粒Cre表达质粒突变基因动物基因打靶过程：P319图14.1，若不需弹出筛选标记见图14.2III二次单交换同源重组（属于无痕操作技术）通过重叠延伸PCR技术连接片段A和C，缺失B片段（数十~数百个密码子序列），得到的AC片段的编码产物缺失了部分氨基酸。如果将该AC片段替代染色体上ABC片段，即可实现基因打靶，而且是无痕操作，没有任何多余的核苷酸残留的染色体上。uppcatABCMCSblaACSinglecrossoverGrowthonMSMmediumcontaining20?M5FUCregionrecombinationAregionrecombinationABCACWildtypeMarkerlessBkonckoutStep3也可利用二次单交换同源重组进行等位基因置换IV其它无痕操作技术Usingthismethod,Kolisnychenkoetal.deleted0.37MbofE.coliDNAconsistingofcrypticprophages,transposons,damagedgenesandgenesofunknownfunction.ThisstrainMDS12resultedina8.3%reductionofgenomecontentSceI+recA重组系统：设计PCR产物（含酶切位点red同源重组诱导SceI表达recA重组修复4.基因抑制技术4.1核酸水平的基因抑制

（1）反义核酸技术（2）共抑制（3）RNA干涉（4）核酶构件

（1）反义核酸技术正义链反义链反义技术：根据碱基互补原理，表达天然的或人工合成的与特定基因互补的反义核酸（RNA或DNA)片段，在胞内形成双链体，从而对特定基因的表达进行抑制或封闭的技术。反义核酸是细胞中（主要在原核细胞中）天然存在的一种调节分子，可以调节基因的转录、mRNA剪切或修饰、蛋白质的翻译过程。

4.1核酸水平的基因抑制5335+-构建反义基因表达载体，转化入反义基因，持续稳定地抑制基因表达。或者直接将反义核酸片段导入细胞，对基因表达进行短期干扰。

根据作用方式不同可将反义核酸技术分为3类：①反义DNA技术：合成的反义寡脱氧核苷酸被摄入靶细胞并与靶mRNA结合，干扰mRNA的转录或阻断蛋白翻译；②反义RNA技术：将反义寡脱氧核苷酸序列连接到载体(病毒、质粒上)导入靶细胞，载入的寡核苷酸转录出反义RNA，与靶mRNA交联，封闭mRNA蛋白翻译过程；（最主要的一类）③核酶技术：核酶是一类具有酶特性的RNA分子，通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性地剪切底物RNA分子，从而阻断基因的表达反义RNA的抑制效果与RNA二级结构有重要关系。在原核细胞中，反义RNA以针对SD序列效果最好，而在真核细胞中以5‘端非编码区为标靶最有效。主要作用机理有以下几种：①mRNA5’端非翻译区，包括sD序列或核糖体结合位点(RBS)；②mRNA5’端编码区，主要是起始密码AUG区域；③mRNA5’末端帽子形成位点区域,阻止mRNA的成熟及其向胞浆中的转运。④前体mRNA外显子与内含子结合部位,干扰剪切和拼接.⑤mRNApolyA形成位点区域，阻止mRNA的成熟，降低稳定性⑥与其靶mRNA结合形成杂交链，容易使RNaseH等核酸酶降解mRNA

反义RNA技术的特点特异性强操作简便，靶mRNA范围广安全性较好抑制基因表达的效率不稳定稳定性方面的改进：对于直接导入细胞的反义核酸，可以使用氨基磷酸核苷酸、硫代磷酸核苷酸等经过化学修饰的底物进行合成，可以更好的抵抗核酸酶的破坏。另外需要增加核酸进入细胞的能力，例如用脂质体包裹、与多聚赖氨酸等连接对于体内表达，可在反义DNA片段的5‘端、3’端加上多余的序列，形成5‘端、3’端的发卡结构，抵御核酸酶降解。（2）共抑制在宿主中导入单个或多个基因拷贝后引起转入的基因表达受到抑制，若转入基因在染色体上有同源基因，还可同时抑制染色体上同源基因的表达该现象首先在植物中发现，其机制非常复杂，可能和转录中及转录后的基因沉默有关，是植物抵抗外来核酸入侵（如病毒）的一种反应

1990年，Napoli等为了加深牵牛花的颜色，转入了多拷贝的牵牛花色素合成基因（编码查儿酮合成酶,可催生红色素），但在部分牵牛花中发现颜色没有变深，反而变浅，甚至部分花朵为纯白色。转基因沉默可以发生在染色体上、转录和转录后三种不同的层次上。发生在染色体上的转基因沉默叫做位置效应，发生在RNA转录水平上的转基因沉默叫做转录失活(transcriptionalinactivation)，而发生在转录后水平的转基因沉默的主要形式是转录后共抑制(post-transcriptionalcosunpression)，共抑制对真核细胞的基因表达是一个障碍。位置效应：转入基因（可以是单拷贝）在寄主染色体基因组上的插入部位及其周围的核苷酸组成，对入转基因表达活性的影响。转录活跃的常染色质区

重复序列区、异染色质区、病毒附近等甲基化强烈、染色体浓缩，引起转基因的沉默转录水平的基因沉默：主要是由于启动子区发生甲基化或是导入的基因发生异染色质化所造成的，二者都和转入基因重复序列有密切关系

外源基因如果以多拷贝的形式整合到染色体DNA的同一位点上，则不能进行转录，故而称为转录失活，且拷贝数越多，基因沉默现象也就越严重。转录后水平的基因沉默：主要是转录后共抑制(post-transcriptionalcosuppression)现象。

转录后水平基因沉默的特点是，外源基因能够转录成mRNA但不能积累，mRNA一经合成就被降解或被相应的反义RNA或蛋白质封闭，从而失去合成蛋白质的功能（机理同RNAi类似）。同时具有扩散性。

依赖于同源性的基因沉默转基因小鼠中带有多个拷贝的-球蛋白基因，随着位点特异性重组的发生，基因拷贝数降低，而小鼠体内-球蛋白基因含量增加，同时随着拷贝数的减少，该位点处的甲基化程度也降低。-球蛋白基因RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发的转录后基因静默机制.RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制.目前已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具（3）RNAi1995年，1995年Guo和Kemphues用反义RNA技术阻断秀丽新小杆线虫,发现注射正义RNA（senseRNA）和反义RNA均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达，该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。直到1998年，Fire等证实Guo等发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量dsRNA而引发，并将这一现象命名为RNAi。

此后dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中，并逐渐证实植物中的转录后基因沉默（posttranscriptionalgenesilencing，PTGS）、共抑制（cosuppression）及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制（quelling）现象均属于RNAi在不同物种的表现形式。2006年，Fire和Mello因为发现RNAi的机理而获得诺贝尔生理医学奖

（1）当病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。（2）宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段双链RNA（大约21～23bp），即siRNA。（3）siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。

RNAi的作用机理（4）RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。（5）siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。应用：构建发卡RNA干扰构件或两端都有启动子的小基因片段来实现基因失活RNAi干扰现象的重要特征RNAi是转录后水平的基因沉默机制；RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA；RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的；RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点;dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡；ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Diecer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。（4）核酶核酶：具有催化作用的RNA分子，能对单链RNA分子进行特异性切割或连接。1982年，Cech等研究原生动物四膜虫rRNA时，首次发现rRNA基因转录产物的I型内含子的剪切及外显子的拼接过程可在无任何蛋白质存在的情况下发生，证明了RNA具有催化功能。1983年Altman等人在研究细菌RNaseP时发现，它具有两个组分：一条RNA链（称为M1-RNA）和一个蛋白质（称为C5蛋白）。它的功能是剪切tRNA分子上多余的或前体序列。而在体外当约400个核苷酸的M1-RNA单独存在时，也具有完成切割tRNA前体的功能，C5起着提高底物与RNaseP亲和力的作用4.1核酶定义及种类

核酶的发现，从根本上改变了以往只有蛋白质才具有催化功能的概念，为此，Cech和Altman也因此获得了1989年的诺贝尔化学奖。目前主要有四类自体剪切型核酶：锤头状核酶，发夹状核酶，瓦库德卫星序列核酶（Varkudsatellite）和丁型肝炎病毒核酶（Hepatitisdeltavirusribozyme）剪接型核酶：为内含子，分为I型（内含子不成环）和II型（内含子成环）剪切型核酶：自体剪切型与异体剪切型（RNaseP）hairpinhepatitisdeltavirushammerhead瓦库德卫星序列核酶含150个以上的核苷酸，是目前发现的分子量最大结构最复杂的自切型核酶每一类核酶都有序列保守的催化中心，天然核酶均发生顺式作用进行自裂解。锤头状核酶的研究最深入、其在基因工程中的应用最具潜力。二级结构自切型核酶锤头状核酶的裂解位点：5′-NUX-3′N为任意碱基，X是除G之外的任意碱基，目前发现的天然核酶中，裂解位点5′-GUC-3′最为常见。虽然天然核酶只能发生顺式作用，但是可以人工合成核酶序列，进行反式作用，裂解目标基因的mRNA，达到抑制基因表达的目的。(破坏环I)4.2锤头状核酶特点中心区（催化）＋反义臂（定位）反式作用抑制基因表达效果非常高一个核酶构件可以破坏许多mRNA动力学特征限制了