说明分析成果

复旦大学生命科学DNAsequencing技术的发展 Walter 1975DNAsequencingdeveloped:WalterGilbertandAllanMaxamofHarvardUniversityandFredSangerofCambridgeUniversitysimultaneouslycomeupwithtwotechniquesfordeterminingtheexactsequenceofbasesthatmakeupagene.GilbertandSangersharethe1980NobelPrize(alsowithPaul方末端终止法Sanger-Coulsondideoxyorenzymatic)sequencing化学裂解法Maxam-Gilbertchemical)DNA300～500技术由三部分产生不同长度的 段,差别仅1个碱基在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳胶的放射性自显影技术末端终止法 DNA合成的底 ordiphosphate

3’-5’phosphodiesterPhosphodiesterbondsin-O-P-O- O

3’-5’Phosphodiester H

3’-5’phosphodiester-O-P-O- H -O-P-O- O HH HDNADNAHDNApolymeraseIfragmentHHHDideoxySequencingofHReactionRequirementsDideoxySequencingof同位素32P35S基本原

DNA序列其独特性在 采用聚丙烯酰胺区分长度仅差1个碱基的单链DNA一个样品的4 可以在一个泳道内电泳，从而降 泳道间迁移率差异对精确性的影响过模板反反应后的变性、毛细管电数据分模板DNA用质粒抽提或胶纯化试剂盒得到的质粒或PCR产物模 在灭菌水里如ddH2O,超纯水；注意不 通过紫外分光光度计测定模板浓度（〉0.1ug/ul质量(OD260/OD280在1.6-1.8之间反 结果一般包括个文件1）.abi件，即测

序列有重复 突 是同语言有关 ,黑猩猩也含有这 .人类因与黑猩猩foxP2顺序只有极少差N冬氨酸T氨酸S,丝氨酸;Q,谷胺酰氨酸 引自:Nature418:869-872,一 缺失(genelosses)点突变--类转换:一种嘌呤转变为另一种嘌呤,A→G或颠换:一种嘧啶转变为另一种嘌呤,或相反C→A或A→T核苷酸插入或缺失突碱基代换会产生4种不同义突变:不改变氨基酸顺序的碱基代 子发生改变的碱基代无义突变:产生终止 的突变,使翻译终止,产连读突变:终止 ,产生延伸的多错义突变的碱基代换发生 的突变, 位置,将终止 子,使翻译延续,产生延长的多肽链. 子的读框,但会增加或减少突 基数不成倍数,使后续 缺失(gene （genetranslocationand某一在肿瘤细胞中从的正常位置转移到其它染色体的某个位置上称为易位或重排。易位与重排易使癌被激活，或是抑癌失活，从而使细胞。细胞癌的编码序列在DNA Burkitt淋巴瘤（8q24异位,激活C-myc）。其它类型 突二 突变的检测方 （allelespecificoligonucleotide,单链构象多态性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP） （一）的检 段，称RFLP。AlleleIIAllele

Allele Allele

BclIRFLP（血友病等 等 特异性寡核苷酸探针及斑点杂交结探 正常探杂交结突变探突变型遗传病的直 诊 突变体富集（mutant-enriched 存在已知的限制性内切酶位点，用连续二次的巢式PCR来扩增包括存在酶位点编码子的DNA片段相应的内切酶消化扩增的DN 段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。化学（Chemicalcleavageofmismatch,基本原理 化学试剂，故又发展了碳化二亚胺检测法refractory ARMS法与 法灵敏度比ARMS技 文单链构象多态性（single-strandconformational 32P-dNTP掺入PCR↓↓单链↓ ↓

2、4、5.该法简单快速，被广泛用于未知突变的检测。由于该法的简便快速，特别适合大样本突变研究的 变性高效液相色谱(DenaturingHighPerformanceLiquidChromatographyDHPLC) 技术特点(HighResolutionMelt,原 变化从而双链DNA在升温过程中先后解开，形成不同融解曲线形状 条件突变检测灵敏HRM DNA甲基化检在哺乳动物细胞中，DNA甲基化主要发生在CpG二核苷胞嘧啶的第五位碳原子上，这样的胞嘧啶也叫做5胞嘧啶，如图所，胚胎及维DNA亚硫酸盐相关方法缺点CGGC将相对而言，Southern方法较复杂存在着酶不完全消化引起的假阳性的问题不适用于混合亚硫盐甲基化的胞嘧啶则不受影响。这样DNA包含的甲基化信息就可转化为序列亚硫酸氢 法（Bisulfitesequencing 处理的序列比较,判断CpG位点是否 JiangM,etal.Rapid ficationofDNAmethylationbymeasuringrelativepeakheightsindirectbisulfite-pcrsequencingtraces.LabInvest2010;90(2):282-90.甲基化特异性的PCR（Methylation-specific MSPCR是一种快速检测方法，只需要及少量DNA样本。MSPCR方法是以引物中所有CpG位点胞嘧啶均甲基片段难扩增，或特异性差等问题，整个CpG岛软件主要作用是辅助设计出具有甲基化(methylation)或硫化(bisulphite)的特殊聚合酶链锁反应的引物(primers)。在进行DNA甲 目前这套专利权仍属于 结合亚硫酸盐的限制性内切酶法（combined 甲基化敏感性单链构象分析sistrand ysis，MS- 被分离开，随后行单链构象多性分 组整体水平的甲基化检甲基 分析针对所有的CpG岛设计探序列制作 ，甲基 Infinium探针设

原理（探针设计型磁珠、U型磁珠。M型磁珠尾部为U型磁珠尾部为A，用来检测未甲基化位点。G仍为G，与MMG变为G，与U型磁珠配对，延伸后U型磁珠发光。Infinium针只使用一种磁珠，探针末端为C。配对后只掺入单个碱基（ddNTP-BioT，ddNTP-DNP）。根据荧光类型判断掺入的碱基类型，第一部 组DNA的提完全可 条件成熟 2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的是不仅没有RNA，连DNA也被消化 第二部分亚硫酸氢钠修 2：加5.5ul新鲜配制的3M342℃水浴4：10mM对苯二酚（氢醌）