PCR32-磁珠柱提取法抽提病毒RNA操作细则

磁珠柱提取法抽提病毒RNA操作细则（上海之江）文件编号：CXCDC/03-WS-PCR322010年8月第1版第1次修订第3页，共3页磁珠柱提取法抽提病毒RNA操作细则（上海之江，ME-0010）1目的对磁珠柱提取病毒RNA方法进行必要的补充和说明。2范围适用于PCR实验室磁珠法提取病毒RNA试剂盒，上海之江。3责任人实验室工作人员。4样品收集和准备4.1样本的采集应符合相关标准规定要求。4.2血清、血浆、含漱液、胸水、腹水、脑脊液、疱疹液、尿液等标本可直接进行RNA抽提。4.3鼻拭子、咽拭子等标本经充分振荡后可直接进行RNA抽提。4.4标本中应无核酸降解酶源，样本在2～8℃可保存2d，长期保存应放置-70℃以下。5实验设备和材料5.1设备和耗材5.1.1一次性防护用品，要求参照生物安全二级防护措施；5.1.25.1.35.1.4多规格Eppendorf微量移液器，覆盖1uL～1000uL全量程；5.1.5高速冷冻离心机；5.1.6混匀仪；5.1.7恒温振荡型金属浴；5.1.8一次性带滤芯盒装灭菌吸头（PCR洁净级），各规格若干；5.1.91.5mL离心管(耐沸腾)，2mL圆底管，亲和柱（试剂盒提供）。5.2试剂和材料5.2.1磁珠柱提取法RNA抽提试剂盒（上海之江，ME-0010）。5.2.2流感病毒培养物（甲1、甲3、乙型、H5流感毒株各200μL）。5.2.3手足口病毒培养物（EV71型、CoxA16型病毒株各200μL）。5.2.4无水乙醇：事先应按要求加入到洗涤液W试剂瓶中，并颠倒混匀。5.2.5其它试剂：二巯基乙醇（β-2ME）、75％乙醇：－20℃保存；RNase的去离子水。5.2.675%酒精或10%次氯酸钠溶液：现配。5.3试剂准备工作5.3.1在RNA助沉剂（CarrierRNA）中加入350μL洗脱液（ElutionSolution）,制成1μg/μLCarrierRNA-ElutionSolution溶液；分装，-20℃储存，可反复冻融3次。5.3.2在洗涤液W（WashSolutionW）加42mL无水乙醇，混匀；拧紧瓶盖，以防止乙醇挥发，并在瓶上做好标记。5.3.3配制结合液：将RNA助沉剂（CarrierRNA）、磁珠加入至结合缓冲液（BindingBuffer），按下表浓度配制。混匀成制成Buffer-CarrierRNA溶液，即为结合液。步骤如下：结合液组成（每人份）1.结合缓冲液（BindingBuffer）500μL2.RNA助沉剂（CarrierRNA）6μL3.磁珠（使用前震荡混匀）20μL5.3.4根据样本数计算每个样本结合液体需要量。n为实际样本数，包括阴性对照、阳性对照和待检标本。则结合液总需要量=n×500μL结合缓冲液+n×6μLRNA助沉剂+n×20μL磁珠。取洁净试管一支，加入上述需要量制成结合液总量，颠倒混悬10次，不可涡旋震荡，以防起泡沫。5.4RNA抽提操作步骤5.4.1吸取526μL结合液于1.5mLEP管中。5.4.2每个EP管加入140μL样本（包括阴性、阳性对照）；用手颠倒5-10次，于室温放置3min以上。5.4.3吸取以上混匀静置体系666μL与亲和柱中，13,000rpm离心40s；弃去收集管。5.4.4取新的2mL收集管套在柱子下面，在柱子中加入500μL洗涤液A（WashSolutionA），13,000rpm离心40秒；弃去液体，不更换收集管。再重复洗一次。5.4.5在柱子中加入500μL洗涤液A，13000rpm离心40秒，弃去离心液及收集管。5.4.5取新的2mL收集管套在柱子下面，在柱子中加入洗涤液W（WashSolutionW），13,000rpm离心15秒，弃去液体，不更换收集管。5.4.6在柱子中再加入500μL洗涤液W，13000rpm离心15秒，弃去液体及收集管。5.4.7准备新的2mL收集管，置亲和柱下面，13000rpm离心2分钟，弃去离心液及收集管。（目的是把残留的RPE尽量离掉）5.4.8取新的无RNAnase的1.5mL离心管置柱子下面，加入50μL65℃预热洗脱液（ElutionSolution），于柱子中膜的中央，室温放置2min。13000rpm离心2分钟，弃去亲和柱，EP中即为RNA。5.4.9将提取的病毒RNA置于－70℃保存备用，或立即进行荧光PCR检测。6注意事项6.1实验前请仔细阅读本试剂盒说明书，严格按照说明书执行操作。6.2实验前的准备：洗涤液W试剂瓶中应事先按标签上的要求加入无水乙醇，并颠倒混匀。保存时注意将瓶盖拧紧，以防止乙醇挥发。6.3阴性对照：核酸提取时以灭菌双蒸水或无RNAnase的去离子水代替标本，每次实验应设立。6.4磁珠在使用前需在旋涡振荡器上充分混匀。如使用工作站提取，磁珠吸取需在振荡器上进行，或每次吸取前进行吹打。且一次吸取的磁珠必须一次放掉，不可对