课件教程说明

SampleSample&Assay2011年11miRNeasy2011年11Chineseprotocol血液中纯化 从人类血液中提取总RNA和本操作流程需要额外订购BufferELcatnoD2、冰上孵育10-15min。在孵育的过程中，短暂涡旋混匀2 孵育时间可以延长至20min。D3、4°C下400xg离心10min后续 例如，在D1步骤中加入的是1mL的血液，则加入2mL的BufferELD5、4°C下400xg离心10min注意：去除上清不完全将会影响之后的裂解释放RNA的步骤，以及之后柱子对D6handbook第19页中的操作步骤（ProtocolPurificationofTotalIncludingSmallRNAs,fromAnimalCells）的第二步。请见下一页PPT

Protocol:PurificationofTotalRNA,IncludingSmall fromAnimal 2、在细胞悬浮液中加入QIAzolLysisReagent注意：细胞不完全悬浮会导致细胞裂解不充分并降低RNA产量3、处理的细胞在3x106以下，则涡旋震荡1min注意：不完全匀质化会导致RNA产量显著减少，并会导致RNeasyMinispin柱子堵塞；匀质化的细胞裂解液可以在–70°C这步有助于提于裂 白复合体5、在装有匀浆的管子中加入140µl氯仿，并盖好盖子。用力震荡15s；6、室温下静置2-3 7、4°C下12,000xg离心15min离心机恢复至室温(15–25°C)离心后，样本将分为三层：上清为无色，是含有RNA的水相； 色有机相。水相上清的体积约为350µl 段，请在这一步之后参照32页的附录A操作9、吸取700µl样本液，包括之前可能产生的沉淀物，加在RNeasyMinispincolumn柱子上（柱子放在一个试剂盒提供的2ml收集管上）。轻轻盖上盖子，在大于8000xg10,000rpm)下室温(15–25°C离心15s。弃掉收集管内的液体。可在第 可选步骤：如果需要进行柱上DNase消化步骤，参照第36页B1-B2B1350µlBufferRWTRNeasyMinispincolumn上，8000xgrpm)下离心15s 柱子。弃掉收集管内的液体。可在B4重复利用该收集管B2、加10µlDNaseIstocksolution在70µl的BufferRDD里。温和翻转离心管混匀液体。不要涡旋震荡。BufferRDD在RNase-FreeDNaseSet里有提供。B3、吸取配置好的DNaseI混合液（80µl）直接加在RNeasyMinispincolumn的膜上，在台上静置15min（20–30°C）。注意：必须确保将配置好的DNaseI混合液（80µl）全部直接加在RNeasyMinispincolumn的膜上，如果一部分混合液站在管壁上或者柱子的管口，将会导致DNase消化不完全。B4、吸取350µlBufferRWT加在RNeasyMinispincolumn上，8000xg(10,000rpm)下离心15s柱子。弃掉收集管内的液体，收集管可重复利用。继续第12 11、可选：吸取700µlBufferRWT加在RNeasyMinispincolumn上。轻轻盖上盖子，8000xg(10,000rpm)下离心15s 如果做了DNase12、吸取500µlBufferRPE加在RNeasyMinispincolumn上。轻轻盖上盖子，8000xg(10,000rpm)下离心15s 13、再一次吸取500µlBufferRPE加在RNeasyMinispincolumn子，8000xg10,000rpm)下离心2min干燥RNeasyMinispincolumn这一步是为了确保没有乙醇转入RNAelution步骤，残留的乙醇会影响后续的注意：离心过后，取出RNeasyMinispincolumn 14、可选：将RNeasyMinispincolumn转于新的2ml收集管中（未提供）旧的收集管和管内液体。小型离心机内全速离心1min这一步是为了消除可能存在于样本中的BufferRPE，或者在13步中残留于柱外15、将RNeasyMinispincolumn转于新的1.5ml的收集管中（已提供）。吸取30–50µlRNase-freewater直接加在柱上。轻轻盖上盖子，8000xg(10,000rpm)下离心1min洗提RNA