CRISPR敲基因的新技术

CRISPR/Cas9

Whatis

CRISPR？

【CRISPR】clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat。

成簇规律间隔短回文重复。是一种基因组编辑工具，它能够完成RNA导向的DNA识别及编辑工具。CRISPR/Cas9系统的发现CRISPR/Cas系统最早是在细菌的天然免疫系统内发现的，其主要功能是对抗入侵的病毒及外源DNA。1987年大阪大学（OsakaUniversity）的研究人员在E.coliK12的碱性磷酸酶基因附近发现了成簇的规律间隔的短回文重复序列（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat,CRISPR），目前普遍认为有40%的细菌基因组具有这样的结构。CRISPR/Cas9系统的组成.CRISPR/Cas9系统由CRISPR序列元件与Cas基因家族组成。其中CRISPR由一系列高度保守的重复序列（repeat）与同样高度保守的间隔序列（spacer）相间排列组成。而在CRISPR附近区域还存在着一部分高度保守的CRISPR相关基因（CRISPR-associatedgene,Casgene）这些基因编码的蛋白具有核酸酶活性的功能域，可以对DNA序列进行特异性的切割。CRISPR/Cas9系统元件与特征CRISPR的结构（以嗜热链球菌LMD-9基因组CRISPR1/Cas系统的位点为例）。蓝色表示Cas基因，包括广泛存在的cas1和cas2，II类系统特征基因cas9和csn2。黑色表示重复间隔物序列（CRISPR）。黑色菱形表示CRISPR的重复序列（repeat）灰色长方形表示间隔物序列（spacer）。缩写：L，前端；T，末端；CRISPR/Cas9系统工作原理CRISPR/Cas作为原核生物中普遍存在的一种系统，最初的功能就是识别外源性入侵的核酸序列，并对其进行特异性降解，以达到抗病毒的作用。这一过程分两步进行——crRNA的合成及在crRNA引导下的RNA结合与剪切，包含crRNA的生物学合成和RNA的结合与剪切两大步骤。CRISPR/Cas9系统工作原理step1CRISPR区域第一个重复序列上游有一段CRISPR的前导序列（Leadersequence），该序列作为启动子来启动后续CRISPR序列的转录，转录生成的RNA被命名为CRISPRRNA（简称crRNA）。step2CRISPR/Cas系统中crRNA与tracrRNA（反式激活的crRNA）形成嵌合RNA分子，即单向导RNA（SingleguideRNA,sgRNA）。sgRNA可以介导Cas9蛋白在特定序列处进行切割，形成DNA双链断裂（Double-StrandedBreak,DSB），从而完成基因定向剪切编辑等各类操作。CRISPR/Cas9系统的分类CRISPR/Cas系统可以分为I类系统、II类系统和III类系统。这三类系统又可以根据其编码Cas蛋白的基因不同而分为更多的亚类。不同类型CRISPR/Cas系统完成干扰的步骤也有所不同。CRISPR/Cas9系统的分类CRISPR/Cas9系统的分类在I类系统中，入侵的DNA有Cascade:crRNA复合体识别，PAM模块则能促进外源性DNA的识别，随后核酸酶Cas3被募集并将目标DNA降解。在II类系统中，只需要单独的Cas9蛋白即可完成干扰，并不依赖一个多蛋白复合体，Cas9和反式激活的crRNA（tracrRNA）、前crRNA（pre-crRNA）形成复合体，该复合体促使RNA酶III将前crRNA加工为成熟的crRNA。在III类系统中，一个多蛋白复合体（Csm或Cmr）或Cas6促进前crRNA转化为成熟的crRNA，最终导致目标DNA的降解II类CRISPR/Cas9系统它是利用一段小向导RNA（sgRNA）Cas9复合体系统靶向基因组编辑的步骤。将编码密码子优化的Cas9（红色）序列、一段核定位序列（NLS）和一段包括目标靶序列的小向导RNA（sgRNA，黄色）序列同时构建在一个质粒中，再将质粒转染进目标细胞。一个有功能的sgRNA:Cas9干扰复合体会在细胞内完成组装，该复合体会在PAM结构的上游目标DNA序列上诱导产生一个双链断裂（DSB），而DSB则能被宿主细胞的DNA修复系统、同源重组系统（HR）和非同源末端连接途径（NHEJ）修复。HR系统以宿主的等位基因为模板复原野生型序列，将序列恢复为断裂前的状态；而容易出错的NHEJ系统则会在目标位点（灰色）引入插入和删失。使用一段合成的供体DNA模板与Cas系统质粒共转染，可以诱导HR（蓝色），提高编辑效率。II类CRISPR/Cas9系统CRISPR技术的应用近年来，由于基因工程技术的突飞猛进，CRISPR/Cas俨然已经成为科学界最炙手可热的热点之一被广泛应用于各类体内和体外体系的遗传学改造、转基因模式动物的构建，甚至基因治疗领域，在结合诱导多能干细胞（iPS）技术，人们可以将通过基因编辑修复的iPS细胞重新发育为正常组织和器官来供病人使用。CRISPR/Cas9存在的问题CRISPR的基因打靶系统，可让我们编辑基因组中特定靶位点的遗传信息。这种新方法揭示的系统，有可能会结合意想不到的位点，导致其中一些位点发生基因突变，这些突变可能对药物疗法的研究与开发，产生严重的后果。CRISPR/Cas9存在的问题同其他基因工程的方法手段一样，CRISPR/Cas9技术手段的产物同样也会存在并引起一些转基因方面的争议。CRISPR技术与其他基因技术对比

THREEONETWOCRISPRZNF

TALENCRISPR技术与其他基因技术对比不论是TALEN技术还是ZFN技术，其定向打靶都依赖于DNA序列特异性结合蛋白模块的合成，这一步骤非常繁琐费时。而CRISPR/Cas技术作为一种最新涌现的基因组编辑工具，能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。CRISPR/Cas技术使用一段序列特异性向导RNA分子（sequence-specificguideRNA）引导核酸内切酶到靶点处，从而完成基因组的编辑。CRISPR/Cas系统的开发为构建更高效的基因定点修饰技术提供了全新的平台。CRISPR技术相关专利科学家杂志4月15日报道，著名的Broad研究院宣布，他们获得了第一份热门基因组编辑技术：CRIS