第4章 载体的选择与构建

第四章

载体的选择与构建主要内容1.细菌质粒载体2.噬菌体载体3.酵母细胞载体及大容量载体4.动、植物载体基因工程载体：

携带外源目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行复制和表达的工具。

★★载体的一般特性：在宿主中能自我复制或借助宿主染色体进行复制容易从宿主细胞中分离纯化具有容纳外源DNA分子的能力有限制性内切酶位点，便于基因组装有对载体进行筛选的标记或报告基因1.1质粒的定义质粒是染杂色体外能进行自主复制的遗传单位，由J.莱德伯格在1952年提出。共生生物、真核生物的细胞器DNA和细菌染色体以外的单纯的DNA分子某些既能独立地存在于细胞质中又能整合在染色体上的质粒称为附加体。酵母的杀伤质粒(killerplasmid)已知是RNA分子。

1.质粒载体1.2质粒的分类1.2.1按照复制性质：严紧型质粒:带有与分配有关的基因，由DNA聚合酶Ⅲ复制，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，1～2个/细胞；松弛型质粒:由DNA聚合酶Ⅰ复制，当染色体复制停止后仍然能继续复制，数十～数百个/细胞一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，例如某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。★★★1.2.2按照构型：环形双链DNA分子共价闭合环状：两条链都保持完整的环状结构，通常呈超螺旋构型开环DNA：一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口线状DNA：这种质粒的双链断裂，由环状变为呈线状这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶中电泳时，出现不同的迁移速率，超螺旋构型最快，其次是线性构型，开环构型最慢。线性质粒

发卡线性质粒：在两端均有反向重复序列，形成共价闭合的发卡环多肽结合质粒：5’端与多肽连接，同时两末端还具有反向重复序列，多为放线菌质粒这些结构可以防止质粒被降解1.2.3按照接合能力:

接合型质粒（F质粒）非接合型质粒1.2.4按照宿主范围:

广宿主质粒（以及穿梭质粒）单一宿主质粒1.2.5按照宿主中的存在形式:

游离型质粒整合型质粒（复制子不能被宿主识别，带有同源片段）1.2.6按照功能：基因克隆质粒（筛选系统，MCS）基因表达质粒(筛选系统，MCS，启动子，RBS，融合tag）基因敲除质粒（筛选系统，目的基因的同源片段）辅助性质粒（例如提供位点特异性重组酶）

1.3质粒的复制1.3.1复制子(replicon)包括复制起点(ori)、复制控制元件、复制蛋白编码基因的遗传单元质粒一般只带有少量复制需要的基因，其它由宿主提供。广宿主质粒一般携带复制所需的所有或大部分基因，而且启动子、RBS位点都可以被多种宿主识别。质粒中除了复制子之外的序列都不是必须序列，可以用其它序列替换来进行基因克隆或表达。pMB1,colE1replicon拷贝数15～20宿主范围小：肠细菌修饰的pMB1replicon拷贝数500～700宿主范围小：肠细菌（pUC系列)pSC101replicon拷贝数5宿主范围广多种革兰氏阴性菌pUB11050广多种革兰氏阳性菌pE1945广多种革兰氏阳性菌★1.3.2拷贝数控制机理反义RNA对拷贝数的调控colE1repliconRNAII被RNaseH切割后充当复制引物链（前导链的引物），而RNAI与其结合后阻止RNaseH的切割质粒编码的Rop蛋白二聚体可提高两种RNA结合复合物的稳定性质粒拷贝数越高，Rop、RNAI浓度越大，最终终止复制细胞分裂后，Rop及RNAI浓度变小，开始进行复制RepA调控Iteronsaredirectlyrepeatedsequences（17～22bp)whichplayanimportantroleinregulationofplasmidcopynumberinbacterialcells（重复子）Ori附近的repA基因编码RepA蛋白，其对自身的表达具有负调节作用RepA蛋白可以和Iterons结合，促进复制复合物的形成，从而开始质粒的复制质粒拷贝数高时，RepA蛋白浓度高，形成二聚体，两个质粒聚集连在一起，复制停止。细胞分裂后重新复制pSC101replicon1.4质粒的不稳定性

分离不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒DNΑ拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体；结构不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒DNA的重排与缺失质粒的分配方式：主动分配平均分配:每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝配对位点分配:只有一对质粒呈主动分配，其余的是随机分配。主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳定性随机分配分配不稳定，部分子细胞没有质粒，并在生长过程中具有优势而逐渐使含质粒细胞比例越来越少★质粒上的par区段编码分配蛋白，质粒上还有par蛋白的结合序列（inc区）负超螺旋密度的增加可以使质粒分配更稳定，par区可以增加负超螺旋密度，DNA促旋酶则降低分配稳定性。(partitionregion）质粒多聚体也导致分配不稳定：质粒多聚体含有多个复制起点，其复制速度是单体的数倍，将导致大量细胞只含有多聚体质粒而影响分配稳定性有的质粒具有宿主致死功能，杀死丢失质粒的细胞，如F质粒的ccdA(编码解毒剂）,ccdB（编码毒性蛋白）

用同一复制系统的两种质粒会在复制和随后向子细胞的分配过程中彼此竟争，这样的质粒在同一个细胞中不能和平共处。这种现象称之为不相容性1.5质粒的不相容性若两种质粒拷贝数不一样，分配有利于高拷贝数质粒★不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子

细菌种类

质粒不相容群

代表性质粒

革兰氏阴性细菌IncFⅠF,R386,R455,ColV

IncFⅡR1,R100

IncFⅢCol1B-K98

IncFⅣR124

IncARA1

IncCR40a,R55

IncHR27,R726

IncIColIb-P9,R144,R483,R64,R621a

IncMR69,R466b

IncNR46,R15,N3,pKM101

IncOR16,R723

IncPRP1,RP4,R68,R751,R690,RK2

IncQRSF1010,pKT212,pKT230,pGSS

IncWR7K,R388,pSA747

IncXR6K

革兰氏阳性细菌pT181pT181,pC221,pS194,pC223,pUB112,pE194

pUB110pBC110,pBC16

pSN2pSN2,pE12,pIM13（1）θ型复制单向复制

双向复制革兰氏阴性细菌中多数质粒是以θ型方式复制，R1，R100等是单向复制，F，R6k等是双向复制类型。1.6质粒的复制方式在革兰氏阳性细菌中大多数质粒是以滚环方式复制，如pC194,pE194等，这种方式会造成质粒结构的不稳定，存在大量的单链质粒DNA（2）滚环复制

质粒转移性：是指质粒能自动地从一个细胞转移到另一个细胞，甚至还能带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移。质粒在细菌间的转移，需要供体和受体细胞间的直接接触才能进行，即接合作用(conjugation)，这类质粒被称为自主转移质粒(self-transmissibleplasmid)或接合质粒(conjugativeplasmid)。有些质粒虽然不能自主转移，但能被其他一些自主转移质粒所转移，这类质粒又被叫做可移动质粒(mobilizableplasmid)，可以借助这种方式将重组质粒导入难于转化的宿主中。1.7质粒的转移性质粒拷贝数转移性质粒拷贝数转移性ColE110-18不能R6k1-2能ColE210-18不能RP44-7能ColE310-18不能pBR322约20不能F因子1-2能pBR325约20不能R1001-2能E.coli

质粒的转移性

G-菌中质粒分子量较大，而G+菌中质粒较小；

已知大肠杆菌的F质粒、R1、R100、ColV、Collb-P9、R6k、RP4等均属于自主转移质粒，它们是低拷贝的大质粒，其中较小的R6k质粒也有38kb。G+细菌如链霉菌中的自主转移质粒，除SCPl是巨大质粒外，很多都是10kb左右的小质粒，而与转移有关的区域只有2kb左右。自主转移质粒的大小差异可能是因为它们的转移机制不同，G+细菌中质粒的转移不需要性菌毛，因此质粒分子量较小。（1）自主转移质粒的特点大多数自主转移质粒都有tra基因和oriT位点，它们在质粒自主转移过程中起着重要作用。

自主转移质粒能诱导含有与自己相同或相似的oriT位点的非自主转移质粒进行转移，如将自主转移质粒整合到染色体上后，带动染色体转移也是从质粒的oriT位点开始的。

tra基因：大多数tra基因的产物与性菌毛的形成(F、RP4和pKMl01都编码一根性菌毛)、杂交对的形成有关；有些tra基因编码作用于oriT位点的内切酶，使质粒中的一条DNA链产生切口，从而开始转移；有些tra基因则与质粒转移调控等有关。oriT位点：oriT位点不仅是质粒转移的起始位点，也是质粒转移后DNA末端再环化的位点，因此质粒必须具有oriT位点才能进行自主转移。（2）

可移动质粒的特点

不能在菌株间形成接合通道：G-细菌中可移动质粒缺少与性菌毛合成有关的基因(约10个左右)。因此，在进行转移时，必须利用位于同一细胞内的自主转移质粒编码合成的性菌毛才能进行。具有特殊的转移起始位点和切割功能基因：如ColEl具有独特的bom位点和负责DNA转移的mob基因。ColEl的bom位点类似于F质粒的oriT。mob基因的功能类似于tra基因，mob基因也能编码特异的核酸内切酶，在bom位点进行切割，但没有编码性菌毛的tra基因，所以它不能自主转移。F质粒诱动ColEl转移的模型图

mob产物bomF-mobF+mobbomF+mob-F+mob+bom-不能转移性菌毛转移不能转移不能转移F质粒1.8报告基因抗生素抗性基因：

kan,cat,bla,spc,em,tet等组织化学显色基因：

E.coli

lacZ，-galactosidase（半乳糖苷酶）

E.coli

gusA（uidA)，

-glucuronidase(GUS，葡萄糖苷醛酸酶）荧光蛋白基因：

rfp，gfp，..荧光素酶基因：luc

荧光素酶在氧化底物荧光素（luciferin）的过程中，会发出生物荧光，可以通过荧光测定仪或液闪仪测定荧光强度。可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。

报告基因：是为基因表达强度、蛋白定位等提供可测信号的一类基因。标记基因：为重组提供筛选标记的一类基因★蓝白斑筛选(互补筛选）原理

载体携带大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸（N端，称为肽）的编码信息。宿主菌缺失lacZ基因的起始氨基酸（met),导致翻译在后续met处开始，其产物为β-半乳糖苷酶的C端，称为ω肽）肽段无催化能力，但可使ω肽段正确折叠并形成稳定的四聚体；ω肽段单独无法正确折叠，因此两个肽段在一起才具有催化活性，这称为互补。载体的肽编码序列中还插入一个不破坏阅读框的多克隆位点（MCS），由MCS编码的少数十几个氨基酸插入到肽的氨基端不会影响其功能，然而，当外源DNA插入MCS后，几乎不可避免地导致其功能丧失。空载体进入宿主后在IPTG诱导下实现互补，β-半乳糖苷酶分解X-Gal产生蓝色物质，菌落为蓝色；连接有插入片段的载体在IPTG诱导下无互补作用，X-Gal不被分解，菌落为白色X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷IPTG:异丙基-β-D-硫代半乳糖苷X-Gluc：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷★MCSPlacX-galBlueX-galNoinsertInsertX-galBlueX-galNocolorNoinsertInsert1.9质粒的提取（1）CsCl-EtBr密度梯度离心(Radloff,1967)溴化乙锭掺入DNA导致密度降低线性DNA和闭环DNA结合的溴化乙锭的量有差异，前者掺入的更多质粒纯度非常高，但耗时、仪器药品昂贵

36万g:6h18万g:48h温和裂解细胞，释放出质粒，而染色体、蛋白及细胞残余通过离心除去★（2）碱裂解法（BirnboimandDoly，1979）线性DNA在pH12~12.6易变性，变性后不易复性而环状DNA不易变性，即使有部分发生变性也容易复性溶液I:50mM葡萄糖（使菌体均匀悬浮，不易沉积结块）

25mMTris-Cl，pH8.0；（缓冲作用）

10mMEDTA（螯合Mg2+等金属离子，失活DNase)25：24：1酚/氯仿/异戊醇：（变性蛋白质）溶液II:0.2NNaOH(裂解细胞、线性DNA变性)1%SDS(与蛋白质结合）溶液III:3M醋酸钾(置换SDS的钠离子，形成沉淀，并与基因组DNA共沉淀）

2M醋酸（中和碱性pH，防止DNA断裂）无水乙醇：沉淀质粒DNA碱裂解法流程图对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时（40-50s)，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。（3）煮沸法原理1.10质粒的改造对天然质粒的改造，原则上仅需要保留其复制子的必需序列和标记基因。尽可能减少分子量，小质粒在提取纯化时不易破坏，可容纳更大的外源DNA。加入多克隆位点（MCS),便于在此处插入各种片段有1-2个可在宿主中表达的标记基因若改造成表达质粒，还需要加入启动子、RBS等元件。多克隆位点：人工合成的，密集排列的，可被多种限制酶识别切割的DNA序列★克隆片段一般插入Ap或Tc中，破坏一个抗性基因正选择方法：分别在含有Ap或Tc的平板上对应点接培养菌株负选择方法：对于Ap,选择培养基中含有淀粉，长出大菌落后倒入含有青霉素和碘的指示剂，Ap抗性菌株将青霉素转化为青霉酮酸，后者和碘结合，四周不会变蓝，而Ap敏感株为蓝色。对于Tc，采用环丝氨酸富集法。抗性株能合成蛋白质，死亡；敏感株不能合成，生长受到抑制pBR322★分子量小，合适的标记，拷贝数较多blatet克隆载体和表达载体示例pUCFrompMB1分子量小合适的标记拷贝数多主要内容1.细菌质粒载体定义，分类，复制机理与方式，不稳定性与不相容性，可移动性报告基因，质粒提取方法与原理2.噬菌体载体3.酵母细胞载体及大容量载体4.动、植物载体2.噬菌体和噬菌体载体1951年，J.Lederberg的妻子EstherLederberg证明了J.Lederberg和Tatum用来杂交的K12中有原噬菌体，并命名为λ，经过约10年的研究搞清了溶源化的实质。

噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。噬菌体基因组为长度约为50kb的双链DNA分子，实际大小为48502bp。其两端的5'末端带有12个碱基的互补单链（粘性末端），称为COS位点；2.1

噬菌体及其生活周期Cohesiveendsite★★λ噬菌体由头和尾构成，其基因组组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。用感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体是应用最为广泛的病毒载体。T偶系列烈性噬菌体

温和噬菌体（λ）晚期基因噬菌体生活周期可选择进入裂解生长状态（lyticgrowth），大量复制并组装成子代噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解。经过40～45min的生长循环，释放出约100个感染性噬菌体颗粒（每个细胞）；或者进入溶源状态（lysogenicstate），将噬菌体基因组DNA通过位点专一性重组整合到宿主的染色体DNA中，并随宿主的繁殖传给子代细胞。当λ噬菌体侵入新的宿主细胞时，裂解和溶原途径以同样的方式开始。二者都需要前早期和后早期基因的表达。但是以后它们就分道扬镳了：如果晚期基因表达了，随之而来的是裂解发育；如果建立起阻遏蛋白cI的大量合成，接着发生的则是溶原化N基因：编码一个抗终止(Antitermination)因子，该因子作用在nut位点，允许转录继续进入后早期基因。cro基因：有双重功能a.阻止阻遏蛋白CI的合成(如果裂解周期继续进行，这种作用是必须的)；b.关闭前早期基因的表达(在裂解周期后期是不需要的)。（1）前早期基因表达后早期基因包括阻遏蛋白基因cI,两个复制基因(裂解侵染所必须)，和7个重组基因(某些与裂解侵染时的重组有关，有两个是溶源时将λDNA整合到细菌染色体中所必需)，还有3个编码调控产物的基因，其调控产物有相反的功能：

cⅡ和cⅢ这对调控产物是启动阻遏蛋白CI合成所必需的。（有利溶源）调控蛋白Q

是一个使宿主RNA聚合酶继续进入晚期基因的抗终止因子(有利裂解）（2）后早期基因表达（3）晚期基因表达晚期基因是作为单独的转录单位表达的，它从位于Q与S之间的启动子PR’处起始。PR’是组成型的,在缺乏基因Q产物时，转录终止在tR3部位。产生的转录物称为6SRNA，长194个碱基;当存在可利用的pQ时，pQ抑制在tR3处的终止作用，使6SRNA延伸，其结果使晚期基因全部表达。（4）cI在溶原化中的作用cⅠ基因是从启动子PRM处转录，转录在该基因的左方停止。由于转录本缺少常见的核糖体结合位点，所以转译效率较差，只产生低含量的阻遏蛋白，此时以单体形式存在。cⅠ浓度高时形成二聚体，可独立地与两个操纵基因OL和OR结合：

1区比2、3区与cⅠ的亲和力高约10倍，cⅠ总是先与1区结合。1区被二聚体结合后增加第二个二聚体与2区的亲和力。当1与2区都被结合时，这种相互作用不再扩大到3区在1、2区的结合阻止启动子PR、PL的启动,同时激活细菌RNA聚合酶在PRM的转录，建立了一个正的自调控回路。阻遏蛋白的浓度变得过大时将占有OR3区，PRM的启动被阻止，

cⅠ的转录终止，从而降低阻遏蛋白浓度。自体正负调控系统★只要阻遏蛋白cⅠ的含量充分，cⅠ基因就持续表达。结果是OL和OR无限期被占用，于是就阻遏了裂解周期，使原噬菌体维持其惰性形式。阻遏蛋白的存在解释了超感染免疫性现象。如果有第二个λ噬菌体DNA进入溶原细胞，由原噬菌体基因合成的cⅠ将立即与新噬菌体的OL和OR结合，阻止第二个噬菌体进入裂解周期。cI基因区段也称为免疫区，表示为imm。cI在溶原化中的作用人工改造的温敏性启动子系统：cITS857+(PL或PR),42℃时阻遏蛋白失活，启动转录；反之31℃时无法转录（5）CII和Cro的作用当λDNA进入新的宿主细胞时，细菌的RNA聚合酶不能转录cⅠ，基因N和cro首先被转录。接着，pN使cⅢ、cⅡ、Q和其它后早期基因转录。CⅡ蛋白激活PRE

（在cro和cⅡ之间）、PI(插入基因int的启动子）及Panti-Q(位于Q基因内)的转录：Cro蛋白（二聚体）通过与PRM作用直接阻止阻遏蛋白的合成，并可关闭早期基因的表达，间接阻止阻遏蛋白的合成。PRE的启动产生了cro反义转录本及cI转录本，导致前者表达终止和最初CI蛋白的合成，CI蛋白启动正自调控系统并终止早期基因转录。此后胞内已合成的CII及CIII迅速被降解（CⅡ在体内极端不稳定，因为有一种HflA的宿主蛋白质使它降解。CⅢ的作用是保护CⅡ抗拒这种降解）。Int基因产物使λDNA整合到宿主染色体上而溶原化Panti-Q的启动产生了Q反义转录本，终止了裂解所需晚期基因的表达Cro对OR3的亲和力比对OR2和OR1的亲和力更强，它首先与3区结合。这个结合抑制了RNA聚合酶与PRM的结合，破坏了溶原维持的正负自调控系统Cro结合在1区或2区（约比CI与该区亲和力低8倍）降低PL和PR的转录水平，降低早期基因(包括Cro自身)的表达水平Hfl：高频溶源化，highfrequencyoflysogenization

★它们之间的区别可归结为：究竟是阻遏蛋白CI还是Cro将获得两个操纵基因的占用权。（6）溶原化还是裂解？建立溶原的起始活动是CI在OL1和OR1处的结合。第一个位点的结合将使另一个阻遏蛋白二聚体在OL2和OR2处的协同结合快速成功。这终止了Cro的表达及Cro与3区的结合机会，并开始经由PRM进行阻遏蛋白的合成。进入裂解周期的起始活动是Cro在OR3处结合，阻止了溶原维持回路在PRM处的开始。接着，Cro必须与OR2或OR1，以及OL2或OL1结合，以降低早期基因的表达来停止合成CⅡ和CⅢ，已合成的CⅡ和CⅢ被降解，导致CI无法继续合成。最初被合成的Q蛋白导致晚期基因表达（噬菌体外壳）细菌生长在丰富的培养基时蛋白酶活性强，CⅡ和CⅢ不能稳定存在，所以λ噬菌体倾向于裂解；当细胞饥饿时，它更倾向于进入溶原(CⅡ和CⅢ较稳定)。当溶源菌受紫外线或丝裂霉素C处理后，会发生SOS反应，激活RecA蛋白，使CⅠ蛋白分解，可以进入裂解期int：整合酶基因，识别宿主细胞染色体DNA和噬菌体DNA上的att位点（PP’与BB’)

，并能催化二者的断裂和再连接。att：附着位点，在宿主细胞DNA上称为attB，在噬菌体DNA上称为attP，两者含有一段15bp的同源序列，重组酶可识别该序列而使噬菌体基因组插入到宿主的染色体DNA上。xis：切除酶基因。

int和xis基因产物共同作用，能使att位点发生重组（PB’与BP’)，并将原噬菌体基因组DNA从宿主染色体中切割下来，使λ噬菌体进入裂解过程。整合和切割都需要来自宿主的一种整合因子Hif协助（7）噬菌体的整合与割离★Holliday连接结构2.2噬菌体载体有长度限制:(75%-105%)×48kb才能被有效包装入蛋白外壳并形成清晰的噬菌斑，必需区长28Kb有相当长的感染非必需序列，这些序列可以删除，或用填补序列取代（保证总长>75%），>75%长度的限制也提供了一种正筛选方法）限制性酶切位点过多可插入的长片段DNA（长至20kb以上），且包装的λ噬菌体感染大肠杆菌比质粒转化细菌的效率高得多，冻藏后存活率高，非常适合于构建cDNA文库或基因组文库。克隆操作要比质粒载体复杂

2.2.1野生型噬菌体载体的一般特点2.2.2噬菌体载体的改造删除多余限制性内切酶位点中段非必需区被替换为某些报告基因或其它正筛选系统，以及和多克隆位点等

★★★2.2.3噬菌体载体的类型插入型载体（如gt10等)替换型载体（如EMBL3等）插入型载体只能承受较小分子量（一般<10kb）的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替换型载体则可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA空载体形成蓝色噬菌斑，插入片段载体形成无色噬菌斑空载体形成浑浊的噬菌斑，插入片段载体形成清晰的噬菌斑Charonvector

卡隆载体★Spi筛选

gam筛选

2.2.4其他筛选系统☆野生型λ噬菌体在带有P2原噬菌体的溶源性E.coli中的生长会受到限制的表型，称作Spi+（sensitivetoP2interference）。如果λ噬菌体缺少两个参与重组的基因red和gam，则可以在P2溶源性E.coli中生长良好，并形成微小的噬菌斑，即Spi-。通过对λ噬菌体载体DNA上的red和gam基因的缺失或替换，可在P2噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组λ噬菌体。只有晚期的滚环复制所形成的线性多聚体λDNA能被有效包装，gam基因是控制λ噬菌体从早期的双向复制模式向晚期的滚环复制模式进行转换的开关，因此gam-则不能大量形成线性多聚体λDNA，只能靠red或宿主的rec重组系统将环状λDNA重组成多聚体（需要chi位点才能高效重组），然后包装成噬菌体颗粒，形成微小的噬菌斑（没有chi位点,crossoverhot-spotinstigator交换热点激活区，只能形成极其微小的噬菌斑）.gam+的噬菌体可以形成清晰的大斑。2.2.5噬菌体载体克隆一般过程★2.2.6噬菌体载体的体外包装如果用DNA直接转染感受态细胞，效率较低:105个噬菌斑/gDNA用载体与外源片段连接后的产物转染：104~103个噬菌斑/gDNA如果包装成噬菌体颗粒感染感受态细胞，则效率很高：高达107/gDNA，每个颗粒转导效率几乎为100%★1.带有互补的缺陷基因，诱导后不能裂解细胞（S基因缺陷），cI857。2.避免内源噬菌体被包装

采用删除原噬菌体b2区而使att位点缺损,这样原噬菌体不能从染色体上割离内源噬菌体采用imm434，包装采用，感染imm434溶源菌，可阻止内源噬菌体形成噬菌斑，而带有外源片段的噬菌体可以成斑

重组缺陷以避免内源噬菌体与重组噬菌体之间发生重组对产生外壳蛋白大肠杆菌的要求：E-、S-D-,S-gene对两种产生外壳蛋白内源噬菌体的要求：434：噬菌体的近亲4342.3单链噬菌体载体及噬菌粒载体M13，f1,fd为大肠杆菌丝状噬菌体，基因组为单链环状DNA，长6.4Kb。M13噬菌体只感染带有F性须大肠杆菌，但其DNA可转染无性须的大肠杆菌2.3.1M13噬菌体载体★★(1)M13的生活周期噬菌体颗粒中的DNA为+链，通过性须进入细胞以+链为模板合成-链，形成RFDNA（复制形式DNA).RFDNA进行数轮复制，+链被切开，以-链为模板进行滚环复制新的+链，并在复制一圈后切割下来、成环。新的+链环继续变为RFDNA，其数目达到200个拷贝，基因V蛋白同+链结合，使-链无法合成，此时只能产生大量+链环状DNA单链链环状DNA被包装成新噬菌体并挤压出细胞膜。宿主细胞不被裂解，只是生长速度变慢ReplicationFormDNA☆(2)M13载体特点无包装限制制备及克隆操作方便可用于制备单链DNA一般插入了MCS，及标记基因★

虽然只有500bp非必需区段（基因II和IV之间），但包装限制方面优于噬菌体，包装长度可达基因组数倍。包装长度越长越不稳定，因此插入片段的长度有限，一般小于1.5Kb细胞内有大量RFDNA,可以用提取质粒的方法大量纯化，进行酶切、连接等操作。重组好的DNA又能高效转染宿主。带有外源片段的M13载体，在宿主中复制后形成的子代噬菌体包装单链DNA,因此可以制备大量单链DNA，用于Sanger测序或制备探针。（两条链都能方便的制备单链）如lacZ的HindII片段（类似于肽），宿主必须为lacZM15突变株（缺第11-41个氨基酸残基，无法形成四聚体），便于筛选重组DNA。（外源片段插入HindII片段中造成肽失活）.如果宿主为lacIq突变，则可表达超量阻遏蛋白，可以用IPTG进行诱导表达。（质粒表达载体一般携带lacI基因来解决该问题）lacZHindII片段M13载体示例

为了克服M13噬菌体的缺点，开发了一类同时含有质粒复制子和丝状噬菌体复制起点的载体系列，称为噬菌粒（phagemid）

兼有丝状噬菌体和质粒的特点：存在辅助噬菌体时：滚环复制产生单链DNA、包装成噬菌体颗粒无辅助噬菌体时：质粒复制子控制复制，可制备大量双链DNA.分子量小，可稳定容纳长达10Kb外源片段，得到长的单链DNA,可省去外源片段从噬菌体载体转移到质粒上的亚克隆过程。克隆过程：载体、DNA片段的体外酶切、连接转化入宿主细胞（蓝白筛选）用辅助噬菌体感染含有重组噬菌粒的细胞收集噬菌体颗粒、制备单链DNA用于测序等后续研究2.3.2噬菌粒载体★pBluescript噬菌粒载体蓝白筛选bla基因体外转录功能★2.3.3M13展示载体噬菌体表面展示技术：在噬菌体颗粒表面表达多肽或蛋白质技术。主要内容1.细菌质粒载体

定义，分类，复制机理与方式，不稳定性与不相容性，可移动性报告基因，质粒提取方法与原理2.噬菌体载体

噬菌体生活周期，主要调控蛋白的作用，载体特点及类型，克隆过程，体外包装过程及注意事项M13生活周期，载体特点，噬菌粒

3.酵母细胞载体及大容量载体4.动、植物载体3.酵母载体及大容量载体

3.1酵母载体3.2柯斯质粒3.3人工染色体3.1常用酵母载体酵母是研究真核生物DNA复制、重组、基因表达和调控的理想受体细胞，也是一种重要的工业微生物，因此需要开发适用于酵母的载体。酵母载体主要是质粒载体：整合型载体（yeastintegerativeplasmid,YIp)

复制性载体（yeastreplicatingplasmid,YRp)

着丝粒载体（yeastcentromere-containingplasmid,YCp)

附加型载体（yeastepisomalplasmid,YEp)特点：具有被E.coli识别的复制子和相应的标记基因，可在其中复制并大量制备。含有在酵母中使用的标记基因（与营养缺陷型宿主基因型互补）具有合适的限制性内切酶位点，方便外源基因的插入。★（1）整合型质粒YIp

该类质粒不能在酵母中自主复制，含有与酵母染色体同源的DNA区段，通过同源重组整合在酵母染色体上。转化效率低：约10个/gDNA，转化子非常稳定，常用于遗传分析。（2）复制性载体YRp与着丝粒质粒YCp酵母染色体总长为15,000kb,根据电镜观察结果预计有400个自主复制序列（ARS,autonomouslyreplicatingsequence)，该序列可用于构建自主复制型质粒。

转化效率较高，104个/gDNA

拷贝数高（1~20），不易分配给子代细胞，质粒分散不均匀转化子不稳定，质粒容易丢失可整合到染色体中，与YIp整合过程相同若在YRp质粒上加入酵母染色体的着丝粒序列（CEN)，则可增加质粒的稳定性（但拷贝数降低为1），这类质粒为YCp，其行为类似染色体，在有丝分裂与减数分裂中可稳定分配到子细胞。（3)附加型载体YEp多数酵母品系中含有一种隐蔽性质粒，称为2m质粒。该质粒的复制系统可以用于构建自主复制性的酵母质粒。

转化效率较高，105个/gDNA

拷贝数高(25~200)，转化子比较稳定易于同内源性2m质粒重组载体类型存在方式所需DNA序列标记基因转化频率稳定性

（菌落/μgDNA）无丝分裂有丝分裂

整合型整合与染色体DNAAprTcr<10+a+a

(YIp5)1-几个拷贝同源URA3

附加体型自主复制2μ质粒AprTcr103-105-b-(YEp13)多拷贝LEU2

复制型自主复制ARSAprTcr

103-104-b-(YRp7)多拷贝TRP1

着丝粒型染色体状ARS,CENApr103-104+c+c(YCp19)通常单拷贝TRP1,URA3

线型染色体状ARS，CENTRP1，HIS3103-104++(YLp21)通常单拷贝TEL

a.每次细胞分裂仍有约1%的载体DNA从染色体上脱落下来b.在选择培养基中15-20代后，10-30%的转化子丢失载体DNAc.无丝分裂时有3-14%转化体丢失质粒，有丝分裂时有3%转化体质粒不发生分离在选择培养基上丢失质粒的转化体低于1%酵母质粒的特征★在染色体遗传作图、DNA文库制备、大片段基因克隆等方面需要应用比噬菌体容量更大的载体1978年由J.Collins和B.Bohn发展的柯斯质粒载体可满足上述需求噬菌体载体最大容量约23kb,实际一般<15kb3.2.柯斯质粒载体柯斯质粒，cosmid,cossite-carryingplasmid,是一类人工构建的含有噬菌体cos位点和质粒复制子的特殊类型质粒。★柯斯质粒pHC79：由质粒pBR322和噬菌体λ的cos位点的一段DNA构成，全长4.3kb具有噬菌体的特性可在体外包装成噬菌体颗粒，转导细胞后利用cos位点环化，采用质粒复制子复制，无法在胞内被包装。具有质粒载体的特性质粒复制子和抗生素抗性基因高容量对于5kb大的柯斯质粒，容量为30~45kb,适合于克隆大片段DNA分子具有与同源序列质粒进行重组的能力

如果胞内还存在含有柯斯质粒同源片段的质粒，很容易形成两种质粒的共合体（1）柯斯质粒的特点★（2）柯斯质粒克隆过程限制酶切割载体和外源片段两种片段混合连接体外包装感染宿主质粒环化、复制★大容量、低本底有效连接产物所占比例较少，使克隆效率较低切割后的片段可能含有多个柯斯载体而造成不稳定可能在染色体作图中给出错误结果优缺点同噬菌体包装原理：含有多个cos位点的多连体被末端酶割，只在两个距离合适的cos位点处切割，相距过近（<37kb)或过远（>52kb)不切割。（3）改良的柯斯克隆过程Ish-Horowicz和Burke方案H两份等量柯斯载体分别单酶切（H/S)后去磷酸化,再单酶切（B）切胶分离纯化左cos片段及右cos片段基因组DNA酶切处理、去磷酸化。左右cos片段和基因组片段混合连接体外包装感染宿主细胞由于大大提高了有效连接产物的比例，克隆效率较高（>105/gDNA)左右cos片段收率低，操作程序繁琐优缺点☆Bates和Swift方案双cos位点的柯斯载体双酶切（B&S)基因组DNA酶切处理、去磷酸化。载体酶切产物与基因组片段混合连接体外包装感染宿主细胞克隆位点两端相向插入不同启动子，可体外转录产生插入片段的两条链的转录本穿梭柯斯载体的构建插入片段易于从载体上切割分离（４）柯斯载体的其它改良☆3.3人工染色体载体根据染色体来源分为：

细菌人工染色体（BACs）

P1派生人工染色体（PACs）酵母人工染色体（YACs）哺乳动物人工染色体（MACs）人类游离人工染色体（HAECs）人工染色体为基因组图谱制作、基因分离以及基因组序列分析提供了有用的工具★人工染色体：artificialchromosome,指人工构建的含有天然染色体基本功能单位(包括复制起始点replicationorigin、着丝粒centromere和端粒telomere)的载体系统。（1）细菌人工染色体和P1派生人工染色体（BACsand

PACs)BAC和PAC是用于原核生物大肠杆菌内的人工染色体。BAC是以F因子为基础构建的环形质粒，容量为～300kbPAC则以P1噬菌体(P1phage)为基础构建的环形质粒，容量为130-150kb。它们不是严格意义上的人工染色体，因为它们不含着丝粒和端粒。★一般结构：携带一个抗生素抗性基因、来源于F因子的严谨型控制复制子oriS、一个易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶repE基因以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因（parA,parB,和parC）拷贝数：BAC载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。克隆能力：大多数BAC文库中克隆的平均大小约120kb，个别的BAC重组子中含有的基因组DNA可达300kb

BACs

1.易于用电击法转化E.coli(转化效率比转化酵母高10-100倍)；

2.超螺旋环状载体，易于操作；（YAC为线状）

3.F质粒的复制系统控制复制，复制稳定，1~2个拷贝，保证分配和结构稳定，很少发生体内重排。

4.宿主E.coli可以构建重组缺陷株，进一步提高BAC的稳定性（酵母细胞无法构建重组缺陷株）BAC的优点：基于P1噬菌体构建的，与柯斯载体工作原理比较相似的一种高容量载体，含有很多P1噬菌体来源的顺式作用元件，能容纳70～100kb大小的基因组DNA片段。含有基因组和载体序列的线状重组分子在体外被组装到P1噬菌体颗粒中，包装容量可达115kb。将重组P1噬菌体颗粒感染表达Cre重组酶的大肠杆菌，线状DNA分子进入宿主后通过载体上两个loxP位点之间的重组而发生环化。载体携带kan基因、克隆筛选系统（sacB系统）、以及一个能够使每个细胞都含有约一个拷贝环状重组质粒的P1质粒复制子。另一个P1复制子（P1裂解性复制子）在可诱导的lac启动子（IPTG诱导）控制下，用于DNA分离前质粒的扩增。P1噬菌体载体（BacteriophageP1vectors）P1噬菌体载体克隆过程类似于cosmid：载体酶切、去磷酸化后产生长臂与短臂长、短臂同酶切去磷酸化的插入片段混合连接，形成多连体分子Pacase识别pac位点进行切割、体外包装感染cre+宿主,在胞内环化2loxPsequencespacsequencepackagingP1phageparticleskanr:kanamycinresistencegeneP1plasmid-replicon:circularDNA(~1copy/cell)P1lyticreplicon:controlledbylacpromoter–forplasmidamplificationpriortoDNAisolation(controlledhighcopy)sacB:positiveselectionforcloningforeignDNA(BamHI-site)betweenSP6&T7promoter在连接过程中产生的环状重组PAC也可用电穿孔的方法导入大肠杆菌中，并且维持单拷贝片段范围更宽60kb～150kbP1人工染色体（P1artificialchromosomes）sacB,positiveselectionmarkerP1plasmidlyticrepliconNOpackagingintoP1phageparticlesTransformationbyelectroporationNOcre-loxPsystemforcircularisation,circularisationusingstandardinvitroligation（2）酵母人工染色体（YACs)YAC载体是利用酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中（2.1）YAC人工染色体载体的元件YAC载体为能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要，必须含有以下元件：端粒重复序列（telomericrepeat，TEL）：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。着丝粒（centromere，CEN）：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如pYAC4使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。自主复制序列（autonomouslyreplicationsequences，ARS）:

一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA进行双向复制所必须的信号。YAC载体主要是用来构建大片段DNA文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。用BamHⅠ切割成线状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要顺式元件。这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，从而决定这个微型染色体可以携带酵母染色体大小的DNA片段。对于BamHⅠ切割后形成的微型酵母染色体，当用EcoRⅠ或SmaⅠ切割抑制基因sup4内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段DNA的目的。装载了外源DNA片段的重组子导致抑制基因sup4插入失活，从而形成红色菌落；而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落。这些红色的装载了不同外源DNA片段的重组酵母菌菌落的群体就构成了YAC文库。

YAC文库装载的DNA片段的大小一般可达200-500kb，有的可达1Mb以上，甚至达到2Mb。（2.2）YAC载体的工作原理★宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2-1（氨基酸密码子变成终止密码子UAA）。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因sup4（Trp-tRNA的反密码子CUA突变成UUA)的载体存在于细胞中时，可抑制ade2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源DNA片段插入的重组子。

宿主菌为营养缺陷型★缺点：在YAC载体的插入片段会出现缺失（deletion）和基因重排（rearrangement）的现象。容易形成嵌合体。嵌合就是在单个YAC中的插入片段由2个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的5%～50%。

YAC染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响了YAC载体的广泛应用。YAC染色体一旦进入酿酒酵母细胞，由于其大小与内源的染色体的大小相近，就很难从中分离出来，不利于进一步分析。优点：酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重复的和极端的DNA有更强的可容忍性。由于容量很大，YAC在功能基因和基因组研究中是一个非常有用的工具。由于高等真核生物的基因大多数是多外显子结构并且有长长的内含子，大型基因组片段可通过YAC载体转移到动物或动物细胞系中，进行功能研究。（2.3）YAC载体的优缺点★哺乳动物人工染色体（MAC，mammalartificialchromosomes

）

哺乳动物人工染色体指从哺乳动物细胞中分离出复制起始区、端粒以及着丝粒构建而成的克隆载体。它可以克隆大于1000kb的外源DNA片段。

应用领域

（1）有丝分裂和减数分裂对DNA片段大小的定量分析（2）研究哺乳动物细胞中染色体功能。（3）对复杂的基因做功能分析。（4）用于体细胞基因治疗。☆人类游离人工染色体（HAEC）人类游离人工染色体（HAEC）是基于人类EB病毒（非洲淋巴瘤病毒）而构建的环形DNA，含有EB病毒的复制原点(oriP)和潮霉素抗性基因。能以环形小染色体形式复制，并在有丝分裂中保持稳定。HAEC可能会成为基因治疗的重要载体。☆主要内容1.细菌质粒载体

定义，分类，复制机理与方式，不稳定性与不相容性，可移动性报告基因，质粒提取方法与原理2.噬菌体载体

噬菌体生活周期，主要调控蛋白的作用，载体特点及类型，克隆过程，体外包装过程及注意事项M13生活周期，载体特点，噬菌粒

3.酵母细胞载体及大容量载体

整合型，复制型，着丝粒型，附加型，COSMID，人工染色体（BAC,PAC,YAC)4.动、植物载体4.动、植物基因工程载体4.1适用于动物的基因工程载体杆状病毒载体

SV40病毒载体逆转录病毒载体痘苗病毒载体(1)杆状病毒载体杆状病毒为双链环状DNA病毒，基因组大小为80-220kb，其宿主为节肢动物，特别易感染昆虫。适宜表达外源基因的杆状病毒载体：真杆状病毒亚科的核型多角体病毒属:NPV（NuclearPolyhedrosisVirus)其中AcNPV（苜蓿银蚊夜蛾NPV）的研究和应用最多。★生理周期：感染细胞，复制DNA进入感染早期，胞内包装成非闭合形式的病毒颗粒，出芽方式释放；感染后期合成大量多角体蛋白，病毒颗粒被多角体蛋白包埋，形成病毒包涵体（闭合病毒），裂解细胞方式释放。病毒包涵体对不利环境的耐受性更强

多角体蛋白基因为非必需基因表达水平非常高（可达总蛋白的50%)

闭合病毒和非闭合病毒感染细胞后形成的空斑不同因此可以根据多角体蛋白的特点对病毒基因组进行改造，构建表达载体：

直接在多角体蛋白基因中设计多克隆位点，插入外源基因：难度大构建辅助质粒，利用同源重组将辅助质粒上外源基因插入AcNPV基因组的多角体蛋白基因中例如：利用pUC18，插入多角体蛋白基因，然后再将外源基因插入其中构建辅助质粒。AcNPV环状基因组可在多角体蛋白基因中间切开，线性DNA感染性很低，从而降低空载体感染的几率同源重组后的病毒无法形成包涵体，而空病毒载体可形成包涵体，通过观察空斑平板上的形态进行筛选缺点：由于空病毒载体在感染早期不合成多角体蛋白，造成假阳性较多。克隆表达策略★其他方案：AcNPV中多角体蛋白基因用lacZ替换，然后切割lacZ线性化病毒DNA，辅助质粒也连上lacZ，并在lacZ中插入外源片段。构建辅助质粒AcNPV基因组切去多角体蛋白基因及其下游复制必需基因改进方案：辅助质粒和线性化的病毒DNA共转染昆虫细胞，通过同源重组使病毒DNA环化,只有发生重组的病毒被复活，重新获得复制能力。★杆状病毒/昆虫表达体系的特点：利用了病毒的强启动子，蛋白表达水平高表达真核基因时产物活性高，蛋白质能进行正确的折叠可以进行翻译后的糖基化，一些治疗蛋白表达后可以部分糖基化，有一定的保真度。昆虫细胞具有很强的蛋白分泌能力，表达的重组蛋白可以分泌到胞外载体容纳大片段的能力强，适合克隆表达大片段外源基因安全性好，杆状病毒不感染脊椎动物，适于表达毒性蛋白或癌基因缺点：糖基化作用不完全，模式也和高等真核生物有区别★(2)SV40载体SV40病毒:猿猴空泡病毒40（SimianVacuolatingvirus40）,是一种哺乳动物病毒，基因组为5.2kb的环状双链DNA。受纳细胞：猿猴细胞，裂解释放病毒颗粒非受纳细胞：小鼠细胞，整合入宿主基因组（细胞被转化），不能复制、包装成病毒颗粒半受纳细胞：人体细胞，部分细胞会裂解，极少数细胞被转化。VP1、VP2、VP3为病毒衣壳蛋白T抗原和宿主细胞某些因子激活病毒复制基因组复制起点附近有一个增强子，主要功能是促进病毒DNA发生有效的早期转录病毒的部分DNA序列被除去，用外源DNA取代，但根据取代序列的不同分为早期区段取代载体和晚期区段取代载体，克隆能力有限，约2.5kb为了补充被取代病毒DNA的功能，必需使用互补的辅助病毒，以便重组病毒能被正常包装。

例如：使用温度敏感变异病毒tsA（41℃无法合成T抗原）作为辅助病毒提供衣壳蛋白，采用晚期区段取代载体（提供T抗原），只有两种病毒共感染的细胞才能形成空斑。对于早期区段取代载体，可以使用染色体上整合有T-抗原基因的COS细胞系做宿主,不再需要辅助病毒。SV40载体的类型用复制起点有缺陷的SV40病毒侵染的猴细胞株CV-1得到的。所以称COS（CV-1，Origin,SV40）COS细胞★SV40存在严格的包装限制，并且几乎没有非必需基因，只能基于该病毒构建取代性载体：用病毒颗粒重新高效感染细胞晚期区段取代载体的克隆过程：病毒-质粒载体：在细菌质粒上加入SV40病毒复制必需的序列，不能被包装成病毒颗粒，是一种穿梭载体。病毒-质粒载体含有的SV40序列包括DNA复制起点、早期和晚期转录启动子及转录起始点，T抗原及其结合位点，SV40早期增强子，细胞内转录因子识别序列，不存在包装限制，插入片段可>10kbGPT：两类载体在细胞中的拷贝数都可达到很高（可达105个/细胞），导致外源基因的高水平表达，但细胞易裂解，不能形成稳定细胞系。改进：去掉T抗原序列，构建整合性载体。黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(3)反转录病毒载体反转录病毒是一类含单链RNA（+）的动物病毒，病毒颗粒一般含两条相同RNA分子，为二倍体。感染细胞，释放RNA，逆转录双链病毒DNA进入细胞核后必须整合入宿主基因组，形成原病毒。原病毒转录成病毒RNA（基因组）和mRNA(生产包装蛋白）细胞被感染后仍然能生长，并不断分泌病毒颗粒生理周期：反转录病毒遗传图谱DNA要比RNA长一些，两端有同向排列的LTR序列（LongTerminalRepeats)，5‘-LTR含有转录起始信号，3’-LTR含有多聚腺苷酸化信号序列。LTR是一个完整的调节区，含有病毒DNA基因组表达所需要的全部调节元件。Ψ

：psi位点，包装识别序列，缺少该序列RNA无法被包装成病毒颗粒。PB:引物结合位点，用于合成cDNA及其第二链gag：病毒外壳蛋白，env：病毒外膜糖蛋白，pol：反转录酶、整合酶、蛋白酶、RNaseH等整合形式的DNA被包装的RNAPolRNA外膜GagEnv提取重组质粒，和辅助病毒DNA共转化宿主细胞，为了避免辅助病毒的包装干扰，可以在外源基因后面加上标记基因（再次用病毒颗粒感染时可以筛选）。或直接转化病毒包装细胞，该细胞基因组上整合有缺失psi位点的病毒DNA，可以生产包装蛋白，但其转录的病毒RNA无法被包装。反转录病毒载体的构建在细菌质粒（如pBR322）上插入原病毒DNA用需要表达的外源基因取代gag,pol和env基因的全部或大部分序列外源基因★逆转录病毒载体特点：载体一旦被包装成病毒颗粒后，转导效率可达100%由于具有细菌质粒的特点，外源基因克隆操作方便，克隆能力约10kb宿主范围广，包括无脊椎动物和脊椎动物病毒本身具有强启动子，可以实现外源基因的高效表达感染细胞后不会导致细胞死亡，传代许多次后子代细胞仍然具有形成病毒颗粒的能力染色体整合机制不详，有激活原癌基因和有害基因的危险因宿主范围广，有一定危险性

病毒包装细胞反转录病毒载体转染可包装的载体RNA反转录酶、整合酶等pol基因产物再次高效感染★（4）痘苗病毒载体痘苗病毒属于动物病毒中的痘病毒，同天花病毒亲缘关系密切，接种痘苗病毒可获得对天花的高免疫性，多用来作为病原体抗原的表达载体痘苗病毒特点：复制和转录在细胞质中进行，而不是细胞核。基因组为线性双链DNA，达187kb。寄主范围广泛，易于培养且非常稳定。有28kb非必需区，至少能容纳25kb外源片段，克隆能力较强。基因组上有胸苷激酶（TK）基因，是一种标记基因，该基因被取代后不影响基因组的复制，因此可以用该基因的插入失活作为筛选标记。TK可将胸苷类似物5-溴尿嘧啶脱氧核苷BUdR掺入DNA分子，使DNA复制出现错误，在UV照射下，具有BUdR-DNA的细胞被杀死。因此在添加BUdR的培养基中，只有TK-细胞可以存活。（宿主细胞也必需是TK-株，以避免对筛选的干扰)★由于痘苗基因组太大，不易进行克隆操作，因此需要借助辅助质粒和同源重组实现外源基因插入痘苗病毒：细菌质粒上插入痘苗病毒的HindIII-J区段，该区段含有tk基因在tk基因中插入启动子和克隆位点将质粒转化感染野生型痘苗病毒的细胞通过同源重组，外源基因插入痘苗病毒质粒载体:Ti质粒病毒载体:花椰菜花叶病毒载体4.2适用于植物的基因工程载体★☆Ti质粒是存在于土壤农杆菌中的一种质粒，可以使植物形成冠瘿瘤，因此称为肿瘤诱导质粒（Tumorinducingplasmid),它可介导细菌与植物细胞的接合，因此可用作植物基因工程载体。4.2.1Ti质粒★环状双链DNA，150~200kb（1）天然Ti质粒的结构★即转移DNA区段，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部分。左边界右边界生长素基因细胞分裂素基因冠瘿碱合成①T-DNA（transfer-DNA）生长素基因:iaaM（tms1）和iaaH（tms2）编码合成吲哚乙酸（植物生长激素）的酶iaaM:色氨酸-2-单加氧酶色氨酸-2-单加氧酶色氨酸吲哚-3-乙酰胺25bp25bpiaaH:吲哚-3-乙酰胺水解酶吲哚-3-乙酰胺水解酶吲哚-3-乙酰胺吲哚乙酸细胞分裂素基因tmr（ipt）：异戊烯转移酶,催化：二磷酸异戊烯（IPP）异戊烯酰嘌呤单磷酸（IPA）5