第3章 代谢控制发酵的基本思想

第三章代谢控制发酵

的基本思想代谢控制发酵课程授课教师：张侠E-mail：zhangxia79@第一节代谢控制发酵的基本思想代谢控制发酵能否获得成功，目的产物的产量高低与否，取决于微生物细胞自我调节控制机制是否能够被解除和解除的程度。最有效的方法就是选育从遗传角度解除了正常代谢控制机制的微生物突变株。代谢控制发酵的基本思想切断支路代谢解除菌体自身的反馈调节增加前体物的合成去除终产物条件突变株的应用选育不生成副产物的菌株一、切断支路代谢1、营养缺陷型突变株（A-）的应用所谓营养缺陷型就是指原菌株由于发生了基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某种物质的能力，必须在培养中外源补加该营养物质才能生长的突变型菌株。由于其在合成途径中某一步骤发生缺陷，致使终产物不能积累，因此，也就遗传性地解除了终产物的反馈调节，使得中间产物或另一分支途径的末端产物得以积累。①无分支途径图谷氨酸棒杆菌鸟氨酸生物合成途径①乙酰谷氨酸合成酶②乙酰谷氨酸激酶③N-乙酰谷氨酸半醛脱氢酶④乙酰鸟氨酸转氨酶⑤乙酰鸟氨酸酶

Arg对①→⑤有反馈调节作用。选育瓜氨酸缺陷突变株（Cit-），亚适量添加瓜氨酸，就会积累大量的鸟氨酸。②分支途径

E、G协同反馈抑制第1个酶的活性和阻遏酶的生成。当菌株失去C→D的能力即成为D或E缺陷型突变株时，解除了E、G对第1个酶的协同反馈调节。当培养基中限量添加E，那么只剩下G对C→F转变的控制，F、G不会过量生成，而使C得以积累。例：利用枯草芽孢杆菌营养缺陷型生产肌苷5－磷酸核糖焦磷酸PRPP谷氨酰胺PRPP转移酶5－磷酸核糖胺腺嘌呤核苷琥珀酸SAMP黄嘌呤核苷酸XMP腺嘌呤核苷酸AMP鸟嘌呤核苷酸GMP5’-IMP肌苷酸肌苷IR肌苷发酵就是通过代谢流的阻塞来消除终产物的反馈调节，以达到中间产物的积累。选用腺嘌呤缺陷型Ade-时，切断了IMP到AMP这条支路代谢，通过在培养基中限量控制腺嘌呤的量，可以解除腺嘌呤系化合物对PRPP转酰胺酶的反馈调节，可以IR得以积累。如果在Ade-基础上再诱变成黄嘌呤缺陷型Xan-或鸟嘌呤缺陷型Gua-，可以切断IMP到GMP这条支路代谢，从而增加IR的积累。③积累另一分支途径的终产物在分支合成途径中，由于存在着多个终产物单独存在时不能对其合成途径的关键酶实现全部反馈抑制或阻遏这一现象，因此，可以利用这种机制选育营养缺陷型菌株，造成一个或两个终产物合成缺陷而使另外的终产物得以积累。通常I、E协同反馈调节途径第一个酶，但菌株丧失C→F的能力，是I、G的双缺陷突变体。若在培养基中亚适量添加I、G，就解除I、E对第一个酶的协同反馈调节，使终产物E大量积累，所以只要选育F或G、I双缺陷型突变株就可以积累E。关键酶天冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制苏氨酸缺陷型高丝氨酸缺陷型例：利用高丝氨酸营养缺陷型(Hom-)或苏氨酸营养缺陷型(Thr-)菌株达到赖氨酸的积累2、渗漏突变株（AL）的应用渗漏突变株就是指遗传性障碍不完全的缺陷型。这种突变是使它的某一种酶的活性下降而不是完全丧失，因此，渗漏缺陷型能够少量地合成某一种代谢最终产物，能在基本培养基上进行少量的生长。由于渗漏缺陷型不能合成过量的最终产物，即解除了反馈调节，所以不会造成反馈抑制而影响中间代谢产物的积累。二、解除菌体自身的反馈调节1、选育抗类似物突变株（Ar）结构类似物：在微生物生理学中是指某些与指定代谢中间产物、合成途径的终产物等空间结构相似而代谢性能不同的化合物。判别结构类似物的要点：一是空间结构类似；二是对微生物有致死性或毒性。结构类似物的作用机理结构类似物由于与代谢产物结构相似，所以同样能与阻遏物以及变构酶相结合。可是它们往往不能代替正常的氨基酸而合成蛋白质，也就是说它们在细胞中的浓度不会降低，因此阻遏物与变构酶的结合是不可逆的。这就使得有关的酶不可逆地停止了合成，或是酶的催化作用不可逆地被抑制。抗类似物突变株：在含一定浓度结构类似物的培养基中仍能生长的突变株。选育抗性突变株，因为代谢调节可被遗传性地解除，在发酵时可不再受培养成分的影响，生产较为稳定，不易发生回复突变，因此在发酵生产上被广泛采用。例：精氨酸的生物合成途径及反馈调节精氨酸的合成受其本身的反馈抑制和反馈阻遏，为了积累像精氨酸这样非支路代谢途径的终产物，主要采用抗精氨酸类似物突变株。D-精氨酸抗性精氨酸氧肟酸盐抗性2、酶特性的利用在育种过程中，当找不到有效类似物时，如果目的产物的生物合成途径中某个酶具有底物专一性宽的特性，则可利用该酶对其它底物的活性，育得代谢调节突变株。例：选育精氨酸生产菌在添加了乙酰赖氨酸和过量精氨酸的培养基中，接种赖氨酸营养缺陷型菌株(Lys-)，从出现的生长菌落中(Lys+)，能够获得精氨酸生物合成酶系的去阻遏突变株。3、营养缺陷型回复突变株的应用当一个菌株由于突变而失去某一遗传性状后，经过回复突变可以再回复其原有的遗传性状，即该酶的活性中心结构可以复原，而调节部位的结构常常并没有恢复，这样可以解除或减弱反馈调节。当难于找到合适类似物或多重抗性交叉难以增加抗性标记，或反馈调节很复杂时，可采用由营养缺陷型选育回复突变株的方法来选育高产菌株。例，先将金霉素生产菌绿链霉菌（Streptomycesviridifaciens）诱变成蛋氨酸缺陷型，再回复突变成原养型，结果其中有5%的回复突变株的金霉素产量提高了1.2-3.2倍。原因是在金霉素的合成过程中，由蛋氨酸供应甲基，蛋氨酸在细胞中的浓度高可以促进金霉素的合成。而回复突变使得蛋氨酸的合成不受反馈抑制，结果使金霉素的含量随蛋氨酸含量的提高而提高。三、增加前体物的合成1、切断共同前体的分支途径

在分支合成途径中，切断目的产物外的其它共用酶的终产物分支合成途径，增加目的产物的前体，使目的产物的产量提高。例：赖氨酸发酵育种上，在解除了赖氨酸反馈调节的基础上，增加丙氨酸营养缺陷等标记可以进一步提高赖氨酸产量。2、解除前体物合成的调节目的产物的生物合成从别的终产物开始时，除设法解除目的产物自身合成的反馈调节外，也应设法解除对其前体物合成的调节。例：异亮氨酸育种苏氨酸是异亮氨酸的前体物。解除苏氨酸的反馈调节，可以获得异亮氨酸的高产菌株。3、增强前体代谢流

在生物合成途径中分支点的代谢流增强，使分支点处的中间产物增多，导致目的产物的积累增加。三羧酸循环的中间产物是谷氨酸生物合成的前体增加乙酰CoA的合成量，就能增大C4二羧酸的消耗，从而增加谷氨酸前体物的生成，提高了谷氨酸的积累。4、利用基因工程技术，将生物合成途径中的关键酶基因克隆到多拷贝载体上，使其大量扩增，从而也就增加了目的产物的前体物的合成，这是最直接的提高目的产物产量的方法。四、去除终产物改变细胞膜渗透性，把反馈控制因子的终产物迅速不断地排出于细胞外，不使终产物积累到引起反馈调节的浓度，就可以预防反馈控制。方法：限量添加生物素；添加脂肪酸类似物；添加青霉素等抗生素；选育丧失脂肪酸合成酶的油酸缺陷型；丧失α-磷酸甘油脱氢酶的甘油缺陷型等在发酵培养基中积累谷氨酸。其方法有：限量供给生物素。五、条件突变株的应用条件突变：因环境条件的不同能显示野生型特性又能显示突变型特性的突变。这主要是在蛋白质的结构基因上发生突变。如温度敏感性突变、抑制性突变、链霉素依赖性突变和低温敏感性突变等。温度敏感性突变：在低温下生长，而在高温下却不能生长繁殖的突变株。温度敏感、在高温下不能生长，是由于该酶受热失活的缘故。如果该酶是氨基酸或核苷酸生物合成途径上的某种酶，那么该突变株在高温下就是一种营养缺陷型。

六、选育不生成副产物的菌株1、有共用前体物的其它分支途径或目的产物是其它产物生物合成途径的前体物时，就附加营养缺陷型，切断其它分支途径或目的产物向其它产物合成的代谢流。AK-Lys-Met-Thr-天冬氨酸发酵2、存在有目的产物分解途径时，应选育丧失目的产物分解酶的突变株。例：选育Thr高产菌PC：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶AK：天冬氨酸激酶HD：高丝氨酸脱氢酶TD：苏氨酸脱氨酶3、当有副产物，特别是有不利于目的产物精制的副产物时，应设法切断副产物的代谢流。例，在异亮氨酸发酵中，副生不利于异亮氨酸精制操作的正缬氨酸和高异亮氨酸。这些副生氨基酸由α-酮丁酸、α-酮-β-甲基戊酸经亮氨酸生物合成途径生成，为亮氨酸所调节。所以，对于异亮氨酸生产菌株来说，如能增加亮氨酸缺陷这一遗传标记，就可以不副生正缬氨酸和高异亮氨酸，达到改良生产菌株的目的。代谢控制发酵的基本思想切断支路代谢解除菌体自身的反馈调节增加前体物的合成去除终产物条件突变株的应用选育不生成副产物的菌株第三节菌种改造的策略菌种改造的目的是：要把出发菌种改造成能在特定条件下进行异常代谢，以实现从原料到目的产物的高效转化的高产菌种。要达到上述目的，可采用“进、通、节、堵、出”五字策略。1、进：促进细胞对碳源等营养物质的吸收。2、通：解除途径中某些酶的反馈调节，或者诱导（激活）这些酶，从而使来自各个分支的碳架物质能畅通地流向目的产物。3、节：阻塞与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物。4、堵：消除或消弱目的产物进一步代谢的途径。5、出：促进目的产物向胞外空间分泌。第四节环境条件控制代谢控制发酵能否获得成功，目的产物产量的高低，取决于其代谢控制机制是否能够解除和解除的程度。同时，发酵的环境条件，如温度、溶解氧、pH值、NH3的供应，营养浓度控制等也非常重要。例：在肌苷发酵过程中，枯草芽孢杆菌在供氧不足的条件下会发生发酵转换，转而积累3-羟基丁酸、2,3-丁二醇和乳酸。CO2对肌苷的产生具有抑制作用。通气搅拌以保证供氧，而且还要考虑适当换气以降低CO2浓度。在保藏