第四章分子发光分析

第四章

分子发光分析法一、分子荧光与磷光产生过程luminescenceprocessofmolecularfluorescencephosphorescence二、激发光谱与荧光光谱excitationspectrumandfluore-scencespectrum三、荧光的产生与分子结构关系

relationbetween

fluorescenceandmolecularstructure四、影响荧光强度的因素factorinfluenced

fluorescence第一节

分子荧光与磷光molecularluminescence

analysis

molecularfluorescenceandphosphorescence2023/2/5

分子发光包括荧光，磷光，化学发光，生物发光。室温下，大多数分子处于基态的最低振动能级，处于基态的分子吸收能量（光能、化学能、电能或热能）后被激发为激发态，激发态不稳定，将很快衰变到基态，若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象称为“发光”。2023/2/5一、荧光与磷光的产生过程

luminescenceprocessofmolecularfluorescencephosphorescence由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1.分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在一系列的振动、转动能级；

用S0表示基态；第一、第二、…电子激发单重态S1、S2…

表示；第一、第二、…电子激发三重态T1、T2

…

表示；V=0,1,2,3表示振动能级。

2023/2/52.电子激发态的多重度

电子激发态的多重度：M=2S+1

S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；

S0→T1

禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；

2023/2/52.激发态→基态的能量传递途径

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和非辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光磷光内转移外转移系间窜越振动弛豫非辐射跃迁激发态→基态：多种途径和方式(见下页能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；2023/2/5S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫2023/2/5非辐射能量传递过程

振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12

s。系间窜越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子的自旋状态。如S1—T1S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫2023/2/5非辐射能量传递过程内转换：相同多重度电子能级间的无辐射跃迁过程。如S2—S1，T2—T1。在10-13～10-11s内完成。

外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫2023/2/5辐射能量传递过程

荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长为‘2的荧光；10-7～10-9

s。

由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，荧光的发射波长比吸收波长要长；‘2>2>1；S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫2023/2/5辐射能量传递过程磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（T1→S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（S0→T1禁阻跃迁）

S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1发光速度很慢：10-4～10s。光照停止后，可持续一段时间S2S1S0T1吸收发射荧光磷光系间窜越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫2023/2/5二、激发光谱与发射光谱

excitationspectrumandfluore-scencespectrum荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？1.荧光(磷光)的激发光谱曲线

固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；2023/2/52.荧光发射光谱(或磷光发射光谱)固定激发光波长(选最大激发波长),

化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。2023/2/53.激发光谱与发射光谱的关系

a.Stokes位移

激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。

2023/2/5b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如‘2

)。

S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫2023/2/5c.

镜像规则通常荧光发射光谱与激发光谱成镜像对称关系。200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱2023/2/5三、荧光的产生与分子结构的关系

relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（f）：表示物质发射荧光的能力2023/2/5

荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，可以用以下数学式表示。如外转换过程速度快，不出现荧光发射；Kf－荧光发射过程的速率常数∑Ki—其他有关过程的速率常数的总和Kf主要决定于物质的化学结构，而∑Ki

则主要决定于物质所处的化学环境。2023/2/52.化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移含→*跃迁能级的芳香族化合物的荧光最强化合物（在环己烷中）φf

λ/nm

苯

0.07283

联苯

0.18316对-联三苯0.933422023/2/5（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。2023/2/5（4）取代基效应：芳环族化合物苯环上不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响，可归为下列几种类型：第一，给电子基团常常使荧光增强；第二，吸电子基团会减弱甚至破坏荧光；第三，同电子体系相互作用小的取代基和烷基对发光影响不明显；第四，将一个高原子序数的原子引入，常常增强磷光而减弱荧光；第五，双取代和多取代较难预测，但若能增加分子的平面性，则荧光增强，反之，则荧光减弱。2023/2/52023/2/5四、影响荧光强度的环境因素

relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure

影响荧光强度的外部因素1.溶剂的影响由于溶质分子与溶剂分子间的作用，使同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱的位置和强度都会有显著的不同

如8-巯基喹啉在下列四种不同极性溶剂中的情况

溶剂介电常数荧光峰λ/nm荧光效率四氯化碳2.243900.002氯仿5.23980.041丙酮21.54050.055乙38.84100.0642023/2/52.温度的影响荧光强度对温度变化敏感，一般来说，溶液的荧光强度随着温度升高而降低。3.溶液pH

带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光一般都与溶液的pH有关，因此在荧光分析中要严格控制溶液的pH值。如苯酚在酸性溶液中呈现荧光，但在碱性溶液中，无荧光再如苯胺在pH7～12溶液中有蓝色荧光，而在pH小于2大于13的溶液中都不发荧光。另外金属离子与有机试剂形成的发光螯合物也受到溶液的pH影响2023/2/54.内滤光作用和自吸收现象

自吸收现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为“内滤光作用”，如色胺酸中的重铬酸钾；2023/2/55.溶液荧光的猝灭荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。（1）碰撞猝灭M+hγ—M*,M*+Q—M+热（2）静态猝灭M+Q—MQ非荧光（3）转入三重态的猝灭三重态O2（4）发生电子转移反应的猝灭M+Q—发生电子转移（5）荧光物质的自猝灭荧光物质浓度较高2023/2/5第四章

分子发光分析法一、仪器与结构流程instrumentandgeneral

process

二、荧光分析法和应用fluorescenceanalysisandapplication三、磷光分析法及应用phosphorescenceanalysisandapplication第二节

分子荧光与磷光分析法molecularluminescence

analysis

molecularfluorescenceandphosphorescenceanalysis

2023/2/5一、仪器结构流程

测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。

特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光源：氙灯和高压汞灯样品池：石英检测器：光电倍增管。2023/2/5二、荧光分析方法与应用1.特点（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；检测下限：0.1～0.001g/cm-3（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱；（3）试样量少

缺点：应用范围小。2023/2/52.定量依据与方法(1)定量依据当荧光物质浓度很小时，荧光强度If与荧光物质浓度c之间的关系式为

If=2.3φfI0εbc式中：φf为荧光效率，I0为激发光的强度，ε荧光物质的摩尔吸收系数，b为试样池的光程，c为荧光物质的浓度。

在一定条件下，φf、I0、ε、b均为常数，所以上式可写成

If=Kc即荧光强度与荧光物质的浓度c成正比。荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限于极稀的溶液。对于较浓溶液，会产生浓度猝灭现象。2023/2/5（2）定量方法标准曲线法：

配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出未知试样的浓度；比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；2023/2/53.荧光分析法的应用目前荧光分析大多用于定量分析，由于自身发射荧光的化合物不多，因此往往利用有机试剂与荧光较弱或不显荧光的物质结合形成发荧光的配合物来进行测定。(1)无机化合物的分析

与有机试剂形成配合物后测量；可测量约60多种元素。（2）有机化合物的分析

芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发生荧光，可以直接进行荧光测定；而脂肪族化合物的分子结构较简单，本身能发荧光的很少，须与某些试剂反应后才能进行分析。2023/2/52023/2/52023/2/5三、磷光分析法及应用

与荧光相比，磷光具有两个特点（1）磷光辐射的波长比荧光长（2）磷光的寿命比荧光长1.磷光强度与磷光物质浓度的关系当磷光物质浓度很小时，磷光强度Ip与磷光物质浓度c之间的关系式为Ip=2.3φpI0εbc式中：φp为磷光效率，I0为激发光的强度，ε磷光物质的摩尔吸收系数，b为试样池的光程。

在一定条件下，φp、I0、ε、b均为常数，所以上式可写成：

Ip=Kc

即磷光强度与磷光物质的浓度c成正比。2023/2/52.温度对磷光强度的影响随着温度的降低，磷光逐渐增强3.重原子效应使用含有重原子的溶剂或在磷光物质中引入重原子取代基，都可以提高磷光物质的磷光强度，这种效应称作重原子效应。4.低温磷光用液氮作冷却剂（77K）2023/2/55.室温磷光由于低温磷光需要低温实验装置、溶剂选择的限制，发展了以下几种室温磷光法：（1）固体表面室温磷光法此法基于测量室温下吸附于固体基质（载体）上的有机化合物所发射的磷光。理想的载体是既能将分析物质牢固地束缚在表面或基质中以增加刚性，并减小三重态的碰撞猝灭等非辐射去活化过程，而本身又不产生磷光背景。2023/2/5（2）胶束增稳的溶液室温磷光法

当向溶液中加入适量的表面活性剂，形成胶束，由于胶束的多相性，改变了磷光团的微环境和定向的约束力，从而强烈影响了磷光团的物理性质，减小了内转化和碰撞能量损失等非辐射去活化过程的趋势，明显增加了三重态的稳定性，从而可以实现在溶液中测量室温磷光。2023/2/56.磷光分析仪

和荧光分析仪器基本相似。在荧光分光光度计上配上磷光附件后，即可用于磷光测定。

（1）试样室

将试样放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，即可用于低温磷光测定。（2）磷光镜

有些物质同时会发生荧光和磷光，为了能在同时有荧光现象的体系中测定磷光，通常必须在激发光单色器和液槽之间以及在液槽和发射光单色器之间各装一个斩波片，并由一个同步马达带动，这种装置称作磷光镜。2023/2/52023/2/57、磷光分析法的应用磷光分析法在无机化合物的测定中应用较少，它主要用于测定有机化合物。(1).稠环芳烃分析采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表(2).农药、生物碱、植物生长激素的分析(3).药物分析见表2023/2/52023/2/5第四章

分子发光分析法

一、基本原理principle

二装置与技术instrumentandtechnology三、化学发光分析的特点characteristics第三节

化学发光分析法molecularluminescence

analysischemiluminescence

analysis2023/2/5化学发光

某些物质在进行化学反应过程中，由于吸收了反应产生的化学能而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。

化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。化学发光分析

利用某些化学反应所产生的光发射现象而建立的一种分析方法。2023/2/5一、基本原理principle1.化学发光反应

在化学反应过程中，某些反应产物接受化学能而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。

A+B=C+D*

D*→D+h（1）能快速地释放出足够的能量。能产生化学发光的物质大多为有机化合物，芳香族化合物；化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当，E=170～300kJ/mol；发光位于可见光区；（2）反应历程有利于激发态产物的形成；（3）激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态；2023/2/52.化学发光效率和发光强度化学效率：发光效率：

化学效率主要取决于发光所依赖的化学反应本身；而发光效率则取决于发光体本身的结构和性质，也受环境的影响。2023/2/5发光强度

化学发光反应的发光强度Icl是以单位时间内发射的光子数表示，它与化学发光反应的速率有关。时刻t的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：

如果反应是一级动力学反应，t时刻的化学发光强度Icl与该时刻的分析物浓度c成正比，即化学发光峰值强度与分析物浓度c成线性关系。在化学发光分析中，常用已知时间内的发光总强度来进行定量分析。2023/2/53.化学发光反应的类型（1）气相化学发光反应主要有O3，NO,S的化学发光反应，可用于监测空气中的O3，NO,NO2，H2S,SO2和CO等.a.一氧化氮与O3的发光反应

NO+O3→NO2*+O2

NO2*→NO2+h发射的光谱范围：600～875nm，灵敏度1ng/cm-3；

2023/2/5b.乙烯与O3的发光反应

乙烯与O3反应，生成激发态甲醛：

CH2O*

→CH2O+h最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1ng/cm-3～1g/cm-3；2023/2/5（2）液相中的化学发光反应机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Au、Th等。应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：0.15～0.05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：2023/2/5（1）该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2）可检测低至10-9mol/L的