第二章核酸化学

第二章核酸化学Hoppe-seyler霍佩-赛勒(ErnstFelixHoppe-Seyler,1825-1895)，德国人。

1877年首次提出Biochemie这个名词，译成英文即Biochemistry，首创蛋白质一词(proteids)。他首次获得纯卵磷脂，曾获得结晶血红素，研究过叶绿素、血液、脓细胞。FriedrichMiescher瑞士科学家(1844-1895)

1868年，FriedrichMiescher从外科绷带上脓细胞的细胞核中分离出了一种有机物质，它的含磷量超过任何一个当时已经发现的有机化合物并且有很强的酸性，由于这种物质是从细胞核中分离出来的，就称之为核素(nuclein)。我们现在知道他分离出来时的是混合物脱氧核糖核蛋白。

二十多年后，1889年R.Altman从酵母和动物细胞核中制得不含蛋白质的核酸，命名nucleicacid。OswaldAvery

1944年,加拿大细菌学家OswaldAvery(1877-1955)美国生物学家Macleod和McCarty发表著名论文,证明DNA是遗传物质。肺炎双球菌:粗糙型,光滑型

大肠杆菌ＤＮＡ豌豆DNAdsDNA1／7核小体1／6螺线管1／40超螺线管1／5染色单体

人细胞含有5.74×109bp，总长约2米，压缩在46个配对的染色体中，总长只有200微米，压缩比达104。polydactyly

核酸是由许多单核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的高分子物质，其基本单位是核苷酸，是由上百个甚至几千万个核苷酸聚合而成的长链。这种长链又称多聚核苷酸。第一节核酸的种类和化学组成ErwinChargaff

DNA和RNA在强酸的作用下可以完全水解，得到磷酸、戊糖和碱基三种组分，DNA中的戊糖是D-2-脱氧戊糖，RNA中的戊糖是D-核糖，核酸分解成核苷酸，核苷酸进一步分解成核苷和磷酸，核苷进一步分解成碱基和戍糖。

在核酸中的含N碱包括嘌呤（purine）和嘧啶（pyrimidine）两类，RNA中所含的是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶(adenine、guanine、cytosine、uracil)。DNA中所含的是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶(thymine)。核酸按其所含的糖不同而分为:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicAcid，简写作DNA）核糖核酸（ribonucleicAcid，简写作RNA）核酸的种类（一）DNA

真核细胞内DNA主要分布在细胞核中，占总量的98%以上，不同各生物的细胞核中的DNA含量有很大差异，但同种生物的体细胞核中的DNA含量是相同的，而性细胞核中DNA含量则占有体细胞的一半，在细胞核内，DNA呈高度卷曲的双股螺旋链状态，与碱性蛋白即组蛋白结合成为染色质。每一个染色质含一个DNA分子，这个DNA分子没有分枝，呈线状。但是，原核细胞的DNA呈环状，存在于拟核内。（二）RNA在细胞内的RNA主要存在于细胞质中，约占90%，不论动、植、微生物细胞内都含有三种主要的RNA。1．核糖体RNA(ribosomalRNA简写作rRNA)rRNA与蛋白质结合而构成核糖体(ribosome)，它是合成蛋白质的细胞器，在核糖体内有三种分子大小不同的rRNA。rRNA约占总RNA的75-80%。

2．转移RNA（transferRNA简写作tRNA）

tRNA分子量最小，约为25000-30000D，核苷酸数目在75-88之间，占总RNA的10-15%，主要功能是携带活化的AA到核糖体上去合成蛋白质，起着转移AA的作用。3．信使mRNA(messengerRNA简称mRNA)，mRNA只占总RNA的5-19%，核苷酸数目在1200左右，mRNA在蛋白质合成是起着决定氨基酸顺序的模板。大肠杆菌的RNA二、核酸的化学组成(一)碱基:基本碱基的结构与命名(A)(G)(C)(T)(U)DNA中的四种碱基及它们间的氢键胞嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌啉腺嘌啉TCAG－CH3Ura与DNA分子中的Thy的区别RNA分子中的四个碱基脱氧核糖

上述的嘌呤或嘧啶碱与核糖或脱氧核糖连接便形成核苷，碱基与戊糖缩合而成有化合物叫核苷，碱基与脱氧戊糖缩合而成的化合物叫脱氧核苷。嘌呤碱以第9位氮与戊糖的第一位碳的半缩醛羟基连接。嘧啶碱则以第1位氮与第一位半缩醛基连接。(二)、核苷(三)核苷酸由核苷和磷酸生成酯，称为核苷酸。由核糖核苷生成的核苷酸称为核苷酸(ribonudeotide)由脱氧核糖核苷生成的核苷酸则称为脱氧核糖核苷酸(deoxyribonudeotide)。磷酸不是同碱基相连，而是同核糖的5’位相连或2’位或3’位相连。ATPdATP4、细胞内核苷酸衍生物环核苷酸:常见的有3’,5’—环腺苷酸cAMP、cGMP。它们是传递激素作用的媒介物,在细胞代谢调节中具有重要作用。第二节DNA的分子结构一、DNA的碱基组成E.charguff规则:1.体细胞碱基组成2.不同生物碱基组成3.亲缘关系相近的生物4.A=T、G=C5.A+G=C+TErwinChargaff二、DNA的一级结构

DNA分子中碱基的排列顺序叫DNA的一级结构。DNA的水解产物中有碱基、磷酸、脱氧核糖、核苷、核苷酸等，因而推测DNA的骨架结构为:DNA结构书写方式:三、DNA的二级结构1.Watson和Crick的DNA的双螺旋结构的模型

Watson-Crick的DNA双螺旋2.0nm结构特征A.两条脱氧核苷酸链的走向：DNA分子由两条多脱氧核苷酸链组成，这两条链都是以磷酸二酯键连接起来的磷酸脱氧核糖长链骨架，位于外侧，以右旋方式围绕一个共同的中轴向前旋绕，但二条链的方向相反，即一条链的走向为3ˊ→5ˊ方向，另一条链为5ˊ→3ˊ走向，二者呈逆平行状态形成双螺旋，在螺旋中形成大沟和小沟。嘌呤和嘧啶碱基重叠于螺旋内侧，碱基平面与纵轴相互垂直。B.

碱基的配对：

碱基的配对是一条链的腺嘌呤与另一条的胸腺嘧啶配对，一条链的鸟嘌呤与另一条胞嘧啶配对，A与T形成两个氢键(A=T)G与C之间形成三个氢键(G≡C)嘌呤，每个碱基之间配对叫互补碱基，并联后的两条多脱氧核苷酸链叫互补链，一条链的碱基顺序确定之后，就可推知另一条链的碱基顺序。碱基氢键配对图1双螺旋分子中糖分子与纵轴平行，与碱基平面垂直稳定双螺旋结构的作用力为氢键和碱基堆积力（即疏水作用）

C.

DNA二级结构呈螺旋上升，旋转过程中每10个核苷酸旋转一圈，螺旋上升一圈，10个核苷酸上升3.4nm，每个核苷酸上升0.34nm，螺旋的直径2nm。一、碱基堆积力：这是主要的稳定因素，因为各个碱基堆积在一起，产生碱基间的范德华引力，使得两条脱氧多核苷酸链成螺旋开稳定结构，碱基堆积力是由于芳香族碱基的π电子之间相互作用而引起的DNA分子中碱基层层堆积，在DNA分子内部形成了一个疏水核心，核心内几乎没有游离水分子，所以使互补的碱基之间形成氢键。2.双螺旋结构稳定性C6H6(benzene)从氢化热看苯的稳定性

碱基堆积力二、碱基对之间的氢键：这种力量比碱基堆积力弱。三、磷酸残基上的负电荷与介质中的阳离子(胺类，金属离子，稳定蛋白)之间形成的离子键。外来的力量！4、DNA双螺旋结构的多态性

以上介绍的DNA双螺旋结构模型是DNA分子在细胞内和水溶液中的主要形式，现在称为B-DNA，它是相对湿度为92%时，DNA-钠盐纤维所呈现的构象。在相对湿度为75%，由B-DNA脱水制成的DNA钠盐纤维为A-DNA。当DNA纤维中的水分再进一步减少时就出现C-DNA。A-DNA、B-DNA、C-DNA都是右手螺旋，它们之间只是碱基的平面不再垂直，而出现不同程度的倾角，螺距和每匝螺旋的碱基数目也发生了改变。A-DNA、B-DNA、C-DNA都是右手螺旋，它们之间只是碱基的平面不再垂直，而出现不同程度的倾角，螺距和每匝螺旋的碱基数目也发生了改变。

但是，Wang和Rich等人在研究人工合成的CGCGCG单晶的X－射线衍射图谱时分别发现这种六聚体的构象与上面讲到的完全不同。它是左手双螺旋，在主链中各个磷酸根呈锯齿状排列，有如“之”字形一样，因此叫它Z构象（英文字Zigzag的第一个字母）。还有，这一构象中的重复单位是二核苷酸而不是单核苷酸；而且Z－DNA只有一个螺旋沟，它相当于B构象中的小沟，它狭而深，大沟则不复存在。

Z-DNA研究表明，Z-DNA的形成是DNA单链上出现嘌呤与嘧啶交替排列所成的。比如CGCGCGCG或者CACACACA。这种碱基排列方式会造成核苷酸的糖苷键的顺式和反式构象的交替存在。当碱基与糖构成反式结构时，它们之间离得远；而当它们成顺式时，就彼此接近。嘧啶糖苷键通常是反式的，而嘌呤糖苷酸键既可成顺式的也可成反式的。而在Z-DNA中，嘌呤碱是顺式的。这样，在Z-DNA中嘧啶的糖苷链离开小沟向外挑出，而嘌呤上的糖苷键则弯向小沟。嘌呤与嘧啶的交替排列就使得糖苷键也是顺式与反式交替排列，从而使Z－DNA主链呈锯齿状或“之”字形。Z-DNA生物学意义这种结构是怎样生成的？这一结构在天然状态下存在吗？它有什么生物学意义？人们相信，并用实验证明细胞DNA分子中确实存在有Z－DNA区。而且，细胞内有一些因素可以促使B－DNA转变为Z－DNA。比如，胞嘧啶第五位碳原子的甲基化。

螺距残基数碱基倾斜

A型(75%,Na)2.81120°B型(92%,Na)3.4100°C型(66%,Li)3.19.36°D/Rhybrid2.81120°Z型4.6129°三股螺旋DNADNA三链结构环型DNA

生物体内有些DNA是以双链环形DNA形式存在的，如某些病毒DNA，噬菌体DNA、细菌质粒DNA、真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA等。在细胞内，由于DNA分子与其他分子的相互作用，使DNA双螺旋进一步扭曲成三级结构，超螺旋是DNA三级结构中最常见的形式。BacteriophageLambdaBacteriophageDNA第三节RNA的结构RNA的碱基组成：RNA中所含的四种基本碱基是：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶，此外还含有几十种修饰碱基。RNA的碱基组成，不象DNA那样具有严格的A=T，G=C的规律，因为RNA的结构不象DNA那样，整个分子都是双螺旋结构。

RNA的一级结构：

核糖核酸的一级结构很象脱氧核糖核酸，是由许许多多的核糖核苷酸借助3ˊ、5ˊ-磷酸二酯键连接而成的多核苷酸链，尽管RNA的核糖Cˊ2上有一自由羟基，但不形成2ˊ，5ˊ-磷酸二酯键，用牛脾磷酸二酯酶降解天然RNA，酶解产物中只有3ˊ-核苷酸，并无2ˊ-核苷酸。RNA结构图RNA转录自DNA一、mRNA

mRNA的一级结构特点：真核细胞的mRNA5ˊ-末端还有一特殊的结构，m7GpppNm，通称为“帽子结构”。5ˊ末端的鸟嘌呤N7被甲基化m7G，核苷酸经过磷酸与相邻的核苷酸（N）相连，形成5ˊ、5ˊ-磷酸二酯键，这个（N）核苷酸的C2ˊ上也是被甲基化了的，这种特殊的5ˊ末端有抗核酸酶水解的作用。Nm表示N核苷酸的C2ˊ上也是被甲基化了。mRNA5'末端的“帽子”结构真核生物的基因结构启动子外显子内含子转录终止子真核基因mRNA的形成极大多数真核细胞mRNA在3ˊ末端连续200个核苷酸均为腺嘌呤核苷酸残基，称为多聚腺苷酸（或称polyA），原核细胞的mRNA其3ˊ端一般没有polyA、polyA的结构与mRNA从细胞转移至细胞质的过程有关，也与mRNA的半衰期有关。新合成的mRNA、polyA较长，衰老的mRNA分子，polyA短。二、tRNA三叶草结构具有下列共同特点。1.

3ˊ末端起为三个不构成碱基对但也不是连接成环的核苷酸，即C-C-AOH，连接它们的是5ˊ-末端形成7个碱基对的一个螺旋区，通常称这一部分为“氨基酸臂”或称氨基酸接受基），因为在蛋白质生物合成中，tRNA运送氨基酸时，氨基酸总是接在3ˊ-末端的腺苷酸上。2.环I由8至11个不能形成碱基对的核苷酸组成的小环，接在由3或4个碱基对形成的另一个螺旋区的一端，此环因含有5、6-二氢尿嘧啶，故称为“二氢尿嘧啶环”（DHU环）。连接此环的螺旋区称二氢尿嘧啶区。3.环Ⅱ为由7个核苷酸组成的小环，它们也都不能互补为碱基对，接在由5个碱基对级成的另一螺旋区一端，位于此环中间部位的三个核苷酸偏成一组，构成所谓的“反密码子”，故称此环为“反密码环”，连接此环的5个碱基对组成的螺旋区称“反密码区”。4.

环Ⅲ为7个核苷酸组成的小环，接在由5个碱基对形成的又一螺旋区的一端，此环因含有修饰核苷Φ（假尿嘧啶核苷）及T（胸腺嘧啶核糖核苷酸残基）并必定含有-T-Φ-C的碱基顺序，所以又称为T-Φ-C环。5.在环Ⅱ与环Ⅲ之间，由3-18个核苷酸组成的“附加叉”又可称额外环或不变环，这些核苷酸以含有较多修饰碱基为其特点，它们有的可形成碱基对，称可变环或额外环，有的不能形成碱基对，在不同种类的tRNA中，额外环的大小很不一致，核苷酸的数目相差很远，所以是tRNA分类的重要指标。tRNA三级结构三.rRNA的结构

原核生物和真核生物的核糖体大小不一样。原核生物（70S）真核生物（80S）核糖体rRNA核糖体rRNA小亚基(30S)16S(40S)18S大亚基(50S)23S、5S(60S)28S、5S、5.8S核糖体由两个亚基组成，每个亚基由数十个蛋白质和3－4种rRNA组成。核糖体的大亚基和小亚基都有结合位点,小亚基有与mRNA结合的部位，大亚基有与tRNA结合的位点，在核糖体内，rRNA以单链存在，而且也和tRNA一样，多核苷酸链发生折叠而形成发夹式结构，同时，也局部呈双螺旋结构，但是rRNA的双螺旋结构没有DNA稳定，它容易因各种因子影响而发生构象变化，如温度、电解质的不同，可以使RNA呈现不同的构象。16SrRNA的二级结构5SrRNA30S亚基的三维结构第四节核酸的理化性质

一、核酸紫外吸收:1.嘌呤碱、嘧啶碱具有共轭双键,使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240-290nm有吸收,在260nm处最大吸收。C=C-C=C

2.纯DNAOD260/OD280=1.8、RNA=2.0,不纯的样品不能用这个方法。这个特性可用来鉴定纯度。3.测定核酸含量：A260:1.OD=50μg/ml双链DNA=40μg/ml单链DNA、RNA=20μg/ml寡核苷酸二、核酸的解离性质:

核酸既有酸性基因，又有碱性基因，是两性电解质。磷酸基在pH>4时，H全部解离，呈多阴离子状态。高等生物中这种状态下的核酸与碱性组蛋白结合而保持稳定。2．碱基的解离也受pH的影响。3．只有在中性条件下才能进行正常的碱基配对。4．核酸的pI=2-2.5,中性带负电，酸性带正电。5.不同的核酸分子解离度不同，电性和带电量不同它们在电场的作用下能向与其相反的电极移动，这种现象，称为电泳。电泳是分离、鉴定核酸及其片段的常用方法。

1.核酸的变性:

当将呈双螺旋结构的DNA溶液缓慢地加热时，其中氢键便断开，双链DNA便解脱成为单链，这叫做核酸的“熔解”或变性。降解:核酸骨架上的3’,5’-磷酸二酯键的断裂、称为降解。三、核酸的变性、复性和分子杂交:2.增色效应核酸变性后，增加了A260的光吸收。A260:1.OD=50μg/ml双链DNA1μg/ml=1/50OD=０.０２OD40μg/ml单链DNA,RNA1μg/ml=1/40OD=０.０２５OD20μg/ml寡核苷酸1μg/ml=1/20OD=０.０５ODDNA的紫外吸收DNA的变性在紫外吸收上的变化Tm值

当DNA从双螺旋结构变为单链的无规则卷曲状态时，它在260nm处的吸收便增加，也就是增色效应，引起DNA发生熔解的温度变化范围只不过几度，这个温度变化范围的中点称为熔解温度（Tm），DNA的Tm值一般在70-85℃之间。

DNA部分变性电镜图不同来源DNA的变性曲线变性的影响因素１．DNA分子的Tm与GC含量有关２．盐浓度对DNA变性的影响

(二)复性与退火

当将双股链呈分散状态的DNA溶解液缓慢冷却时，它们又可以发生不同程度的重新结合，而形成双股螺旋结构，这种现象称为“退火”（annealing）。在适宜的温度条件下，分散开的两条DNA链可以完全重新结合成和原来一样的双股螺旋。这个螺旋的重组过程称为“复性”（renaturation）。DNA的变性与复性DNA浓度与复性时间的关系T1/2×C＝constCot曲线的另一种表达形式人类DNA的Cot曲线

哺乳动物的DNA一般均呈右图的曲线，这是因为它们的基因组DNA中插入了大量的重复序列，如人的DNA中就插入了长度为350bp的Alu序列达50万份拷贝之多。DNA部分变性电镜图

5ˊAGCT3ˊ

5ˊAGCT3ˊ3ˊTCGA5ˊ

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Questions5ˊAGCT3ˊ

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Questions:

1.If5ˊACAGCTTTGGT3ˊ

+

3ˊTCGA

5ˊ