第3节细胞培养的应用

第三节

细胞培养的应用一、植物细胞培养与次生代谢产物制备植物细胞培养定义：

指在离体条件下，将愈伤组织等置于液体培养基中振荡培养，得到分散游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。（一）大规模植物细胞培养1.单细胞制备方法

（1）机械法：（2）酶解法：（3）愈伤组织诱导法：高频振荡使愈伤组织分散成单个细胞（二）大规模植物细胞培养1.悬浮培养

将细胞接种于液体培养基中并保持良好的分散状态.特点:与培养液充分接触,促进营养吸收和气体供应;细胞增殖快,获得高浓度细胞.（二）大规模植物细胞培养2.固定化培养

将游离细胞包埋在支持物内部或表面进行培养的一种方法.特点:维持细胞良好的稳定性。方法：

吸附固定法、离子/共价交联法、共价结合法、包埋法、微囊化等。3.大规模植物细胞的生物反应器（1-1）机械搅拌式反应器优点：混合性能好传氧效率高操作弹性大可用于细胞高密度培养；缺点：剪切力大。（1-1）机械搅拌式反应器搅拌式反应器结构示意图1—搅拌器；2—罐体；3—夹套；4—搅拌轴；5—压出管；6—支座；7—人孔；8—轴封；9—传动装置

典型的搅拌结构（1-2）非机械搅拌式反应器

非搅拌式反应器所产生的剪切力较小，结构简单。其主要类型有鼓泡式反应器、气升式反应器等气体搅拌式反应器气升式反应器鼓泡式反应器1—分布格板；2—夹套；3—气体分布器；4—塔体；5—挡板；6—塔外换热器；7—液体捕集器；8—扩大段（1-3）组合式反应器利用“优势互补”原则，将两种反应器结合起来研究出组合式反应器。带有低速搅拌的气升式发酵罐可弥补低气速时混合性差的弱点。（1-4）光生物反应器（1-5）转鼓式生物反应器（2-1）固定化培养的生物反应器——流化床两类:液-固两相气-液-固三相优点：细胞与流体能充分混合、接触。不足：细胞与流体碰撞易伤细胞（2-2）固定化培养生物反应器——固定化床固定床生物反应器两类:填充床反应器涓流床反应器（三）植物细胞培养制备代谢产物

细胞代谢产物包括初级代谢产物与次级代谢产物.1.初级代谢产物：

通过初级代谢产生的维持细胞生命活动必需的物质。如：AA、核苷酸、多糖、维生素等。2.次级代谢产物：

通过次级代谢合成的分子结构较复杂的小分子化合物。如：抗生素、生物碱、毒素等。（三）植物细胞培养制备代谢产物次级代谢产物的利用：

（1）药用：如紫杉醇、生物碱类、萜类等（2）食品、食品添加剂：如胡萝卜素、甜菊苷、辣椒素等。（3）杀虫剂、杀菌剂：如万寿菊细胞培养产物农药噻吩烷、葫芦巴培养产物蓝鱼藤酮等。（4）饲料、精细化工产品：（四）生产次生代谢产物的细胞株要求分散好,适合于大规模悬浮培养;均一性好,大小与生理状况一致;生长快;目标产物含量高;细胞遗传性能稳定.二、动物细胞培养与表达制备药用蛋白

1962年开始，用于生物医学研究，生产酶制剂，生长因子，疫苗，单抗等。如：纤溶酶原激活剂（t-PA）、神经生长因子（NGF）、乙肝疫苗（HbsAg）、干扰素（IFN）、白介素（IL）等（一）病毒疫苗生产：Vero细胞培养DMEM培养基胎牛血清其他成分锥形瓶逐级放大培养加碱（碳酸氢钠）加糖（葡萄糖）灌注培养液微载体5L种子罐培养培养液50L生物反应器接种狂犬病毒出液口收获病毒（二）基因工程药物生产——重组干扰素（IFN）定义：

由病毒或诱生剂刺激机体细胞产生的具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的糖蛋白。

种类：

IFN-α——白细胞产生；IFN-β——成纤维细胞产生；IFN-γ——致敏T细胞产生干扰素作用机制干扰素的生产：传统方法：从人血液中的白细胞内提取每300L血液才能提取1mg

基因工程：将干扰素基因转移到大肠杆菌中。每千克培养液可提取20-40mg。我国的基因工程重组IFN有:

α1b(如赛若金:科兴\军事预防科学院等)α2b(如安达芬:长春生物等)细胞IFN诱生剂产生特异性因子，使阻抑蛋白灭活干扰素基因解除抑制IFN基因活化产生干扰素体内干扰素产生机制:重组干扰素生产机制干扰素生产车间实例：（1）过程1表示可以通过人工合成方法获得干扰素基因。其主要步骤可概括为：由干扰素中_______顺序推导出__________顺序，再进一步推导出_______顺序。人工合成的干扰素基因在实验室可通过_____技术进行人工扩增。氨基酸mRNA的碱基基因的碱基PCR实例：（2）过程2需要的工具酶有__________________。（3）欲将大肠杆菌b筛选出来，应利用基因表达载体（重组DNA分子）上的_____。（4）干扰素不能在高温环境中保存，其原因是_____________________________。限制性内切酶和DNA连接酶标记基因干扰素是蛋白质，高温下会变性（三）单克隆抗体生产1.何谓单克隆抗体？

通过B细胞杂交瘤技术,获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体.

单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myelomacell)与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridomacell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridomatechnology）。2.杂交瘤技术的基本原理2.杂交瘤技术的基本原理实例：下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌抗体的实验方案。请据图回答：

（1）该方案能达到预期效果吗？

。原因是没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生单一抗体的效应B细胞

不能（2）图中②为

过程，常用

作为诱导剂。该细胞继承了

，因此不仅能

，还有

本领。（3）图中③进行细胞培养，目的是

。

细胞融合和筛选灭活的病毒双亲细胞的遗传物质大量繁殖产生特异性抗体在体外条件下大量增殖（4）在制备破伤风杆菌抗体的过程中，进行了两次筛选，其目的不同，②是通过筛选获得

，④是通过筛选获得

。（5）图中⑤的培养能获得

细胞，便于大规模培养。杂交瘤细胞能产生特定