第四章,色谱分析仪器及技术

第四章

色谱分析仪器与技术谢国明重点提示1.色谱法的基本原理是什么？2.色谱法的分类和特点是什么？3.色谱分析的常用术语和参数有哪些？4.气相色谱仪的基本结构是怎样的？5.气相色谱仪常用的检测器有哪些？6.高效液相色谱仪的构造和工作原理是什么？7.高效液相色谱仪常用的检测器有哪些？目录第一节

色谱法的原理与分类第二节

气相色谱仪第三节

高效液相色谱仪第四节

色谱仪的数据处理系统第五节

色谱仪在临床实验室的应用第一节

色谱法的原理与分类一、色谱法的基本原理色谱分离中的两相:固定相和流动相色谱法利用待分离的样品组分在两相中分配的差异而实现分离。色谱分离的两要素是互不相溶的两相以及样品各组分在两相中分配的差异。这是决定色谱最终分离结果好坏的基础。

色谱工作就是使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用（分配、吸附、离子交换等）。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，吸附力大的固着不动或移动缓慢，吸附力小的被流动相溶剂洗下来随流动相向下流动，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。

K=Cs╱Cm=（Xs/Vs）╱（Xm/Vm）一、色谱法的基本原理色谱分离原理示意图样品1样品2样品3响应R2进样峰时间（t）13色谱柱（固定相）

流动相112223333二、色谱法的分类与特点（一）色谱法的分类按流动相和固定相物理状态分类：气/液相、气液/固按所利用的物理化学原理分类：吸附、分配、离子交换按操作形式分类：柱、纸、薄层、棒按色谱动力学过程分类：冲洗、顶替（二）色谱法的特点应用范围广、样品用量少、选择性高、效能高和灵敏度高。三、色谱分析的常用术语和参数色谱图检测器响应R基线b空气峰a进样峰h123时间t(min)tRatR1tR2tR3进样峰三、色谱分析的常用术语和参数1.色谱图色谱分离分析过程中，所记录的检测器响应信号随时间变化的曲线叫做色谱图。2.基线表明纯流动相流过检测器时所产生的响应，反映了检测器噪声随时间变化的情况。3.色谱峰

样品中分离出的各组分进入检测器时，色谱流出曲线就会偏离基线，检测器的输出信号根据流入组分的浓度或质量的变化显示出的峰，即为色谱峰。三、色谱分析的常用术语和参数4.进样峰和空气峰进样峰是进样时操作条件被干扰出现的，也可在进样时通过连动装置进行标记，是色谱分离过程中时间的起点。空气峰是由于空气等物质不被固定相吸收，最先被流动相冲洗出来到达检测器而形成的峰形。5.保留参数保留时间、死时间和死体积6.峰高

色谱峰顶点与基线之间的垂直距离称为峰高（peakheight），单位为mV。7.峰宽参数峰底宽、半峰宽、标准偏差。第二节

气相色谱仪第二节

气相色谱仪载气源减压阀净化器稳压阀稳流阀气化室色谱柱检测器放大器记录仪温度控制系统

气相色谱仪方框图气相色谱仪主要由气路系统、进样系统、分离系统、检测系统、温度控制系统、数据处理、记录系统及电源、电子线路等构成。一、气路系统（一）载气源和减压阀载气一般选用氦气、氮气、氢气或氩气。气体贮存在高压罐中。减压阀的作用是把气体的压强从10MPa～15MPa的高压降低至0.2MPa～0.4MPa的工作压强。（二）净化器用于净化载气，去除其中的水分、有机烃类杂质，碳氢化合物、二氧化碳和其他惰性气体。（三）稳压阀和稳流阀作用为控制载气流量和压强，保证载气的平稳性。二、进样系统（一）载气预热器、取样器载气预热器用于载气加热，以防止气化后的样品遇到冷的载气后被冷凝，影响样品的分离。取样器通常使用微升注射器，将液体样品注入色谱柱。常用5μl和10μl注射器。若为气态样品，则需气密注射器。（二）进样气化装置作用是接收样品后，立即使其气化。为使样品集中地成一窄带状被带入色谱柱，要求死体积尽量小，峰扩展尽量小。载气入口接色谱柱散热片（预热）加热块汽化室示意图取样器三、气相色谱柱与温度控制（一）气相色谱柱

1.固定相-----注：极性对极性色谱柱是整个气相色谱系统的核心，样品各个组分的分离便在此完成。优良的色谱柱应具有适当的尺寸和固定相。

2.柱管形状和尺寸柱管形状：U型管、盘形管和螺线管，以U型管最常用。柱子的尺寸应对容量（样品量）和分析速度最佳化。为获得最大效率，可用内径较小（相对接触面积）、长度较长的毛细管柱。当分析的样品量较大且分离不困难时，可用内径较大、长度较短的填充柱。三、气相色谱柱与温度控制（二）温度控制温度对于固定相极为重要。操作时必须要知道所用固定相温度的极限，把全部操作保持在临界温度下10℃～15℃进行。在气相色谱仪中，温度不仅对样品在色谱柱上的分离过程有很大影响，对许多检测器（如热导、电子捕获、示差折光等）的检测结果也有很大影响。控温的关键在于温度的稳定性。温度控制一般是通过对具有一定体积的恒温箱内部的温度控制来实现的。三、气相色谱柱与温度控制（二）温度控制温度控制要求为：①点温度的稳定性；②温度场的均匀性；③恒温范围可以调节；④绝热性能好，从启动到稳定点的时间要短；⑤要有足够的可用恒温空间，供装色谱柱之用。温度控制器主要有：开关式、比例调节器式、作用调节器式。四、程序升温控制系统气相色谱仪的温度控制方式：恒温：适用于样品中各组分的沸点分布范围较窄时，用恒温操作，可以得到较好分离结果。程序升温：当样品中各组分的沸点相差较明显时(一般在沸点分布范围大于80℃～100℃时)，此时最好使用程序升温。四、程序升温控制系统（一）恒温控制系统恒温是指在整个工作过程中温度始终控制在设定的范围内。恒温控制系统是一种闭环负反馈自动控制系统，由恒温控制电路、恒温箱及测温、补偿等环节构成。（二）程序升温控制系统程序升温就是指色谱柱的温度在分离的过程中按照预定的程序逐步增加。常用的程序升温方式有：

线性程序（单阶线性升温）非线性程序（多阶线性升温）四、程序升温控制系统1.线性程序即柱温T随时间变化成比例地升高。可表示为T=T0＋rT，式中T0为初温，℃；t表示时间，min；r代表升温速度，℃/min。2.非线性程序线性－恒温适于高沸点组分较多的样品的分离。

恒温－线性

适于低沸点组分较多的样品的分离。

恒温－线性－恒温

适于组分沸点范围很宽的样品。

多种升温速度

适于复杂样品。3.程序升温控制方式电子式机电式四、程序升温控制系统4．程序升温操作中须注意的问题升温方式：根据样品的性质决定。起始温度：根据样品中沸点最低组分的沸点决定，起始温度在其附近或稍低一点均可。升温速度:影响到分离效率和分析时间。终止温度:取决于固定液的最高使用温度及高沸点组分的沸点。可以以其中较低的温度为依据来确定终止温度。五、气相色谱仪常用检测器（一）气相色谱仪检测器分类1.积分型检测器积分型检测器的响应信号与分离出组分的总量成正比，色谱图是一种阶梯状曲线。一个阶梯表示一种物质从色谱柱中分离出来，阶梯的垂直高度与该物质的总量成比例。每一个峰代表一种物质的出现，峰与基线所界定的面积与样品组分的含量成比例。

2.微分型检测器微分型检测器的响应与已分离组分在载气中的浓度或质量流速有关，记录仪记录下来的色谱图是常见的峰形曲线。微分型检测器分为浓度检测器（第一类）和质量流速检测器（第二类）。.㎏/(m2•s)五、气相色谱仪常用检测器（1）浓度型检测器浓度型检测器的输出信号与被分离的组分在载气中的浓度成比例。色谱流出曲线上的每一点都对应于该瞬间组分在载气中的浓度。如上图,峰a为某组分的响应曲线。峰面积为A1组分全部质量为M，系统工作在线性范围之内，即K1为一常数,则检测器的响应为：五、气相色谱仪常用检测器（2）质量流速检测器质量流速检测器的输出信号与已分离组分流过检测器的质量流速（单位时间内通过的组分质量）成比例。色谱峰上的每一点都对应于分离物质该瞬时的质量流速，系统工作在线性范围之内，即K2为一常数。A2=K2M

五、气相色谱仪常用检测器（二）气相色谱仪常用的检测器1.热导检测器

（thermalconductivitydetector，TCD）由热导池、测量桥路、热敏元件、稳压电路、信号衰减及基线调节等部分组成；具有结构简单，线性、稳定性好，适用范围广等特点，还可与其他检测器联用。适用于有机化合物的检测

2.氢火焰离子化检测器

（hydrogenflameionizationdetector，FID）简称氢焰检测器，是电离检测器的一种，属第二类（质量流速类）检测器。由电极、电离室、离子源、极化电源、本底电流补偿环节以及静电计、记录仪等构成。

热导检测器检测原理是载气和样品各组分具有不同的导热系数。热导检测器基本原理图记录仪输出电阻E电桥参比热导池热敏元件载气支承丝工作热导池＋－＋－氢焰检测器基本原理图R0E0记录仪本底电流补偿环节离子源电极电离室极化电源第二节气相色谱仪五、气相色谱仪常用检测器3.电子捕获检测器（electroncapturedetector，ECD）放射性电子捕获检测器，由一个阴极（内装圆筒状β放射源3H或63Ni的池体）和一个不锈钢阳极组成，其离子化源为放射性核素；非放射性电子捕获检测器，其离子化源是低能电子。电子捕获检测器灵敏度最高，线性范围较窄，常用于痕量分析。4.脉冲放电检测器（pulseddischargedetector，PDD）一种氦光离子化检测器，当用纯氦作载气和放电气体时，它具有通用型检测器的功能；既能灵敏地检测无机气体，又能灵敏地检测有机化合物。记录仪数据处理放大器极化电源出口63Ni放射源阳极阴极(池体)绝缘体载气＋样品电子捕获检测器基本原理图六、气相色谱仪的工作原理气态样品或经气化室气化了的液态样品被载气（流动相）带入色谱柱（固定相）。在色谱柱中经过多次反复吸附—脱附—析出的分配过程后，依次离开色谱柱，进入检测器；检测器把流入的组分定量的转换成电信号，经放大处理后，送往显示与记录系统，从而得到被测样品各个组分的色谱图。柱参数的合理选择影响分离效果，柱参数就是有关色谱操作的所有参数的统称。气相色谱仪的流程图六、气相色谱仪的工作原理气相色谱仪的参数选择

1.色谱柱和填料

所有新色谱柱使用前必须经老化处理以除去填料中的污染物和减轻对检测器的污染。

2.色谱柱长

选择柱长的依据是分离度和分离速度。

3.载气流速

以兼顾灵敏度和分辨率为出发点。六、气相色谱仪的工作原理气相色谱仪的参数选择

4.进样器和检测器的温度

温度比恒温箱最高温度高出25～50℃，防止样品组分冷凝。5.恒温操作

温度一般要求比样品最高沸点低40℃左右。原则是温度每上升1℃，保留时间缩短5%。温度每上升30℃，分配系数下降一半，分析速度加快一倍。6.程序操作

，常用线性升温。第三节高效液相色谱仪第三节

高效液相色谱仪HPLC废液分离柱检测器数据处理器进样装置温控装置流量控制器梯度装置高压泵记录仪脱气装置储液槽高效液相色谱仪主要由溶剂输送系统、进样系统、分离系统（色谱柱）、温度控制系统、检测系统和数据处理与显示系统等构成。一、溶剂输送系统溶剂输送系统应具备宽的流速范围和入口压力范围，并能适用于所有的溶剂。溶剂输送系统主要由液源（储液槽）、脱气装置、高压输液泵、流量控制器和梯度洗脱装置等构成。其中：储液槽是装溶剂的容器，必须能够容纳色谱连续工作所需要的较大量的溶剂。脱气装置主要用于除去溶解在溶剂中的空气和其他气体。一、溶剂输送系统（一）高压输液泵作用：将洗脱液连续不断地送入分离柱以完成色谱分离过程，其性能对分离和检测均有很明显的影响。分类：恒压泵，常用的有直接气动泵和气动放大泵等；恒流泵，最常用的高压泵是机械往复式柱塞泵。出口入口

单向阀液缸

柱塞

凸轮机械往复式柱塞泵示意图第三节高效液相色谱仪一、溶剂输送系统（二）梯度洗脱及洗脱方式等度洗脱（isocraticelution）在样品的分离过程中从始至终采用相同的流动相和相同的流量来完成样品分离。梯度洗脱（gradientelution）在色谱的分离过程中，把两种或更多的不同极性互溶的洗脱液随时间按某种变化的比例混合，使流入色谱柱的洗脱液组成作连续的改变，目的是让样品的每一个组分都在最佳分配系数的条件下分离出来，以获得较好的峰形。（内外梯度）K=化合物在固定相中的溶解浓度化合物在流动相中的溶解浓度

K值小，先流出柱子，K值大的，保留作用强，后流出柱子。等度洗脱：

对于一些复杂样品各组分的K值对任意一种流动相都分布很宽时，分配比小的先出色谱柱，但往往分离不好，甚至不能完全分离。而最后出来的若干组分因时间太长，峰形扩散，致使检测器的灵敏度显著降低，甚至无法检出。解决此问题可用下列措施：1.程序升温（气相）

2.组合柱

3.梯度洗脱（最常用）内：改变流量外：改变流动相组成一、溶剂输送系统（三）流量控制器柱反压高压的流动相流经色谱柱时，与固定相产生相互作用，形成与流动相流动方向相反的作用力，即构成一个与流向相反的压力，称为柱反压，它阻碍流动相的正常流动。流量控制器的作用是防止过高的色谱柱反压对分离造成不良影响。二、进样系统高效液相色谱仪进样系统的要求是能将样品有效地注入到系统里去，且不破坏在色谱柱和检测器里所建立的流量平衡。理想的进样系统应能给系统带来最低限度的死体积，否则柱效率将受到损失。进样装置有多种，包括注射器、多通进样阀和自动进样器。二、进样系统（一）注射器直接注射器进样进样时注射器直接插入色谱柱上端的进样器隔膜，将样品注入到色谱柱中固定相的顶端，可在不停流情况下进样。针头可顶到色谱柱口，因而死体积小，峰扩展小，有利于分离，但进样量重复性差。隔断式注射器进样隔断式进样器是在不进样时用隔断器将进样系统与流动相隔断开，进样时将隔断器提起，让进样系统与流动相连通，将注射器针头插到色谱柱顶端进样。流动相带着样品进入色谱柱，进样完毕马上关闭隔断器。二、进样系统导向头亚硝基氟橡胶密封圈

隔断式注射进样器洗脱液色谱柱二、进样系统（二）高压进样阀四通阀、六通阀等，承受高压的能力和密封性要求更严格。常用的是旋转式六通阀。进样量准确、重复性好是旋转式六通阀的最大优点，其缺点是死体积较大，峰的扩展也较注射器严重。一般适于在高压条件下且样品量较大时的自动进样。开始分析废液样品

淋洗液至分离柱进样阀样品装样废液

淋洗液至分离柱（ＬＯＡＤ）（ＩＮＪＥＣＴ）样品环定量环进样三、分离系统和温度控制系统（一）柱管材料、几何形状和尺寸1.材料

色谱柱管的材料有不锈钢、厚壁玻璃和石英。工作压力超过3.92MPa时，必须用不锈钢管柱。2.形状

柱管的形状有直管柱和螺旋柱。现在基本上都采用直管柱。3.尺寸

柱长和内径是由实际需要的分离度、压力降、分析时间以及样品量的大小综合决定的。要求柱管内壁经抛光处理，内径上下一致，以免引起流量变化。装柱时将柱内固定相上、下面与密封过滤片接触面顶紧，以免出现柱头下陷，影响柱效。三、分离系统和温度控制系统凝胶过滤色谱柱不锈钢色谱柱亲和层系色谱柱厚壁玻璃色谱柱三、分离系统和温度控制系统（二）固定相和流动相选择适当的流动相，可使分离效果得到改善。正确选择流动相的基本原则：①稳定性好，柱效率长期不变。②适应所采用的检测器。③能溶解待分离样品。④清洗方便。⑤粘度要小一些。

三、分离系统和温度控制系统（二）固定相和流动相1.液固吸附色谱法固定相是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，吸附剂大部分以硅胶为基体。2.液液分配色谱法在载体（担体）上涂敷一层固定液作为固定相。正向分离：用极性固定液和非极性流动相来分析极性化合物的色谱系统。反向分离：指用非极性固定液和极性流动相来分析非极性化合物的色谱系统。液－液分配色谱的固定相为涂渍在载体上的固定液涂渍了固定液的载体1－流动相；2－固定液液膜；3－毛细深孔和渗入的固定液；4－液固界面；5－液液界面三、分离系统和温度控制系统（三）温度控制系统控温装置是通过对恒温箱的温度控制来实现对色谱柱的温度控制；一般都采用闭环负反馈的温度控制方式；将色谱柱连同整个检测系统均放在恒温箱内，使之保持大致相同的温度，可得到较好效果。第三节高效液相色谱仪四、检测器（一）基本要求和分类

1.对流动相的适应如果流动相的特性参数与待分离物中某一组分相同，或者多元流动相对同一原理的检测器具有不同的参数值，都会使检测器无法正常工作。2.峰扩展由于流动相的流速相对较慢，峰扩展的问题更为突出，要求检测器的空间及测量系统的时间常数尽可能小。四、检测器（二）常用检测器总体型检测器保持溶质在溶剂中，即流动相加已分离组分直接进入检测器检测，即对洗脱液和组分总体的物理性质（如折光率、电导率等）进行检测，如示差折光检测器、紫外-可见光检测器、微量吸附热检测器等。溶质型检测器把从色谱柱流出物的溶质和溶剂分开，让溶质单独进入检测器，如热导检测器、氢火焰离子化检测器、电子捕获检测器等。四、检测器紫外-可见光检测器结构与紫外-可见分光光度计基本相同。高效液相色谱仪中最常用的检测器。具有灵敏度和检测精度高、线性范围宽、受流量和温度波动的影响小、适用于梯度洗脱及不破坏样品等特点一种选择性检测器，但是只能用于在工作波长范围内有吸收的样品。2.二极管阵列检测器先让所有波长的光都通过流动池，然后通过后分光技术，使所有波长的光在接受器上被检出。相当于与紫外联用；色谱峰纯度鉴定、光谱图检索等功能，可提供组分的定性信息。四、检测器3.示差折光检测器主要由光源系统、光路系统、接收、放大、记录系统组成。通过检测折射率的变化，达到分析样品各组分的目的。灵敏度较低，不适合做痕量分析。也不适合梯度洗脱。4.荧光检测器

荧光检测器是用紫外光照射样品，通过光电倍增管检测样品所发出的荧光，记录色谱图。荧光检测器又分为多波长荧光检测器和荧光分光检测器。荧光检测器在选择性和灵敏度方面优于紫外检测器，是选择性检测器，被检样品必须能够被激发出荧光。检测器的主要性能性能/检测器紫外荧光折光安培电导（二极管）测量参数吸光度荧光强度折射率电流电导率类型选择性选择性通用选择性选择性池体积1～103～203～10﹤11噪声/测量参数单位10-410-310-710-910-3最小检测浓度/g/mL10-1010-1110-710-12103线性范围103103104105104温度影响小小大大大流速影响无无有有有可否用于梯度洗脱能能不能不能不能对样品有无破性无无无无无五、操作条件的选择1.流动相的流量提高流量可以缩短分析时间，但会降低分离度，增加柱压。分析时常常选则10ml/min以下流量。制备时流量可大一些。2.柱温高效液相色谱仪的工作一般在室温下进行。一般不通过调整柱温来提高分离能力。3.压力高压可提高分析速度。一般可在3.43～34.32MPa之间选取，最高不能超过49.03MPa。4.进样量高效液相色谱仪注重的是分析速度及分离能力，极小的进样量有利于这两项指标。第四节

色谱仪的数据处理系统一、数据处理系统1.积分仪主要有模拟和数字积分仪两种类型。主要功能是得出色谱图上的峰面积。积分仪可以准确地计算出峰面积，为定量分析打下基础。2.色谱工作站

硬件是指信号采集单元，将色谱仪输出的电压信号转变为电脑能够接受的离散数字信号，起着电脑与色谱仪之间的接口转换作用。软件部分主要有系统软件、控制软件、采样软件和各种数据处理软件包；接受色谱信号数据，提供人机窗口界面，对色谱图进行各种处理的参与仪器的自动控制的计算机程序集。一、数据处理系统

数字积分仪二、计算机在色谱仪中的功能1.分析信息处理

①峰的处理；②计算峰高；③峰面积积分。2.数据演算功能

进行总和校正、成分比率、移动平均、线性多项式演算等数据计算。3.程序控制功能

实现程序升温、程序变流速、梯度洗脱、程序变压、阀门切换、流路切换、衰减程序、大气压平衡等一系列程序操作，自动控制色谱工作过程中的操作条件。二、计算机在色谱仪中的功能4.存储器的保存功能

内部电池支撑内存保存、磁盘内数据的输入和输出。5.自动标定功能

自动标定保留时间、死时间、峰高等基本参数。

6.异常检出和显示功能

异常检出功能对信息处理器进行自检，以保证数据处理的准确性。一旦