微卫星多重PCR扩增技术

鱼类育种学实验内容：微卫星多重PCR扩增技术实验目的掌握SSR分子标记技术的原理与分析方法；学习多重PCR技术，了解体系优化的方法；掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法；掌握银染的实验方法。实验一PCR反应及体系优化实验材料与仪器材料：团头鲂DNA模板（浓度：100ng/μl）仪器用具：PCR仪，制冰机，紫外反射投射检测仪，微量移液器，冰箱，天平，电泳仪，电泳槽，烧杯，量筒，200ulPCR管，Taq酶，dNTPs，引物，PCR缓冲液，石蜡油，电泳所需试剂，溴酚蓝，琼脂糖，硼酸，Tris碱，蒸馏水，离心管。实验步骤PCR反应液配置－PCR扩增－产物检测－程序优化－PCR扩增－产物检测－结果分析多重PCR扩增体系为20μl：包括100ng基因组DNA，1×PCR缓冲液，Mg2+(1.5mmol/L)，1UTaq酶，dNTPs0.2mmol/L，多重PCR扩增体系内各位点上、下游引物分别为0.25μmol/L试剂体积三重PCR体系(μl)四重PCR体系(μl)H2O13.713.2Buffer2.02.0Mg2+1.21.2dNTP0.40.4Primer-1(F/R)0.25+0.250.25+0.25Primer-2(F/R)0.25+0.250.25+0.25Primer-3(F/R)0.25+0.250.25+0.25Primer-4(F/R)--0.25+0.25Taq酶0.20.2DNA(100ng/μl)11Total20μl20μl体系名称引物组合产物大小3-7Mam_EST811290-320Mam_EST129200-250Mam_EST64140-1704-5Mam_EST179360-400Mam_EST11290-330Mam_EST90200-250Mam_EST37140-180PCR程序：95C3min95C30sTa30s32cycles72C45s72C5min4Cforever

注：对Ta进行梯度优化，设置4个温度梯度－50，54，58，62。聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液配置：5×TBE：54gTris碱，27.5g硼酸，20ml0.5mol/LEDTA（pH8.0），加ddH2O定容至1000ml。40％丙烯酰胺：380g丙烯酰胺，20g甲叉-丙烯酰胺，加ddH2O定容至1000ml。0.5mol/LEDTA（pH8.0）：186.1gEDTA•Na•2H2O，800mlddH2O，NaOH调pH至8.0（about20gNaOH），加ddH2O定容至1000ml，高压灭菌。10％APS：1gAPS，加ddH2O定容至10ml，置于4C。8%non-denaturingPAGEgel:

40%丙烯酰胺14mlddH2O41ml5×TBE14ml10％APS650μlTEMED65μl染色液－0.1％AgNO3：0.5gAgNO3，加ddH2O定容至500ml，置于4C。显色液：10gNaOH，0.2gNaCO3，ddH2O定容至500ml，置于4C保存，用时加2ml37％formaldehyde。固定液－10％冰醋酸银染步骤：1.取下凝胶用去离子水冼胶2min；2.0.1%硝酸银染色10－15min；3.弃去染色液,蒸馏水洗胶30s；4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止；5.