酵母双杂交系统技术介绍

酵母双杂交系统

技术介绍

05February2023宝日医生物技术（北京）有限公司主要内容背景介绍:关注蛋白质背景介绍:为什么要研究蛋白互作？背景介绍:Clontech酵母双杂交系统的功能背景介绍:Clontech分子生物学工具ClontechMatchmaker™背景介绍:MatchmakerGold系统背景介绍:Matchmaker

Gold系统原理ReporterGeneReporterGeneReporterGene主要内容基本原理:酵母双杂交参考文献Nature.1989Jul20;340(6230):245-6.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.FieldsS,SongO.DepartmentofMicrobiology,StateUniversityofNewYorkatStonyBrook,StonyBrook11794.63000次引用基本原理:GAL4转录因子的结构ADDNA-BDGAL4蛋白具有两个功能结构域BD结合结构域AD激活结构域基本原理:GAL4转录因子的分子机理在GAL4based双杂交系统中:正常情况在酵母细胞内:PromotergalmetabolicgeneGALUASTranscriptionADBDReporterGeneGAL4AD基本原理:三个启动子，四个报告基因获得阳性克隆子报告基因表达AbA抗性筛选Ade营养筛选His营养筛选X-a-gal蓝白筛选M1G1G2降低假阳性！主要内容ClontechMM系统的优点SMART方法与同源重组技术结合构建文库，聪明的酵母自己做克隆。AbA抗性筛选的添加，有效抑制背景生长，大大降低假阳性。文库构建于型酵母菌株α型Y187中，方便后续与a型菌株Y2HGold进行mating直接筛选。ClontechMM系统:蛋白互作基本流程验证蛋白互作自己构建文库：630490预制细菌文库：638802（传统型）预制酵母菌文库：630480（均一化，通用型）

Clontech蛋白互作相关试剂盒文库筛选文库构建酵母双杂交系统：630489酵母菌转化试剂盒：630439酵母培养基（套装）：630495插入片段检测：630497酵母质粒提取：630467体内验证：630489630305体外Co-IP验证：630458630459631723631604文库构建:ClontechMM文库构建方法SMART合成cDNA共转化，涂板

培养，收集菌液

文库分装，冻存1mlmatingAAAAAAAAATTTTTTTTCCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGCCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGLD-PCRCCCAAAAAAAATTTTTTTTGGGSMART合成cDNA共转化，涂板

培养，收集菌液

文库分装，冻存1mlmating聪明的酵母自己做克隆SD/Leu-Y187同源重组SMARTcDNA两小时构建文库文库构建:ClontechMM文库构建方法SMART合成cDNA共转化，涂板

培养，收集菌液

文库分装，冻存1mlmatingSD/Leu-文库构建:ClontechMM文库构建方法文库构建:ClontechMM自制文库筛选SMART合成cDNA共转化，涂板

培养，收集菌液

文库分装，冻存1mlmatingY187，AD文库Y2HGold，BD诱饵培养液DDO/X/A混合QDO/X/A文库筛选:ClontechMM文库筛选630489Matchmaker™GoldYeastTwo-HybridSystem两个载体两个菌株转化试剂盒control630489Y187Y2HGold三个载体阳性对照，阴性对照。BDvector：pGBKT7ADvector:pGADT7630439极大提高转化率可以单独购买文库筛选:ClontechMM系统质粒诱饵载体InY2HGold文库筛选:诱饵载体构建及其自激活检测Y2HGold诱饵载体文库筛选:Mating方法筛选Y187α型DDO筛选二倍体Y2HGolda

型Mating接合反应

酵母的有性生殖过程，Clontech利用这个过程，实现了文库筛选。

ADBDMixMatingQDO筛选文库筛选:均一化通用文库筛选均一化通用型文库高丰度与低丰度均衡大大降低工作量大大降低假阳性更高的基因代表性NormalizedUniversalPre.libraryY187，AD文库Y2HGold，BD诱饵培养液DDO/X/A混合QDO/X/A文库筛选:传统细菌文库筛选文库培养提取质粒转化酵母菌取1ml菌液按照一定比例用LB稀释，150ul/板进行涂板，过夜培养。将提取的质粒转化Y187，获得酵母文库。Mating筛选将文库与诱饵培养液混合，进行Mating。涂筛选板，挑取阳性克隆子。刮取平板上的菌落，提取质粒。文库筛选:验证阳性克隆子（PCR确认）25ul2×mix30PCRcycles25ulH2O630497Matchmaker™InsertCheckPCRMix2文库筛选:酵母质粒提取630467EasyyeastPlasmidIsolationKit验证互作:体内验证SEAP630305MammalianMatchmakerTwo-HybridAssayKit2验证互作:体外Co-IP验证BaitAcGFP1PLPreyProteinA/GAgarosebeadsMatchmakerChemiluminescentCo-IPVectorSet（630458）MatchmakerChemiluminescentCo-IPKit（630459）ProlabelChemiluminescentDetectionKit（631723）

验证互作:体外Co-IP验证实验流程PL检测验证互作:FRET分析632466pDsRed-Monomer-C1Vector632470pAcGFP1-C1-VectorClontechMatchmaker系统产品选择指南TheFRIGIDAComplexActivatesTranscriptionofFLC,aStrongFloweringRepressorinArabidopsis,byRecruitingChromatinModificationFactorsKChoi,JKim,HJHwang,SKim…-ThePlantCell…,2011-AmSocPlantBiolExtracellularsignal-regulatedkinase8(Erk8)controlsestrogen-relatedreceptorα(ERRα)cellularlocalizationandinhibitsitstranscriptionalactivityMRossi,DColecchia,CIavarone,AStrambi…-JournalofBiological…,2011–ASBMBWSB-1,anovelIL-21receptorbindingmolecule,enhancesthematurationofIL-21receptorHNara,TOnoda,MRahman,AAraki…-Cellular…,2011–ElsevierFHL1interactswithoestrogenreceptorsandregulatesbreastcancercellgrowthLDing,CNiu,YZheng,ZXiong…-JournalofCellular…,2011-WileyOnlineLibraryRab4interactswiththehumanP‐glycoproteinandmodulatesitssurfaceexpressioninmultidrugresistantK562cellsCFerrándiz‐Huertas…-…JournalofCancer,2011-WileyOnlineLibrary6.DuplicatedC-classMADS-boxgenesrevealdistinctrolesingynostemiumdevelopmentinCymbidiumensifolium(Orchidaceae)SYWang,PFLee,YILee,YYHsiao…-PlantandCell…,2011-JpnSocPlantPhysiolProteinInteractionDomainMappingofHumanKinetochoreProteinBlinkinRevealsaConsensusMotifforBindingofSpindleAssemblyCheckpointProteinsBub1andBubR1

TKiyomitsu,HMurakami…-MolecularandCellular…,2011-AmSocMicrobiol

ClontechMatchmaker系统近期参考文献主要内容常见问题分析:酵母双杂交文库如何获得？购买Clontech公司预制文库用630490自己构建文库请Takara公司提供文库构建服务如何获得酵母双杂交文库常见问题分析:一定要做自激活检测吗？必须滴！自激活检测必须做：1.需要在Y2HGold菌株中进行。2.如果出现自激活现象需要调整AbA浓度或者调整序列。3.如果菌落生长过慢，可能是表达有毒性，需要用低拷贝质粒pGBT9(630490提供)。常见问题分析:诱饵的大小有限制吗？我们有文献报道的8-750个氨基酸都有成功的案例。Heery,D.M.etal.(1997)Nature387(6634):733–736.2.SchaeferB.C.,Ed.(1997)GeneCl