-土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

尿素分子的立体结构土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、课题背景1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+CO2NH3+H2O3、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。4、课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一.研究思路㈠.筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置对照（一）筛选菌株水生耐热细菌Taq(Thermus

aquaticus

)——耐高温的TaqDNA聚合酶美国微生物学科布鲁克1966年发现耐热细菌在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。1、实验室微生物的筛选原理（P21）

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。（一）筛选菌株2、选择培养基

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。（一）筛选菌株1.在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？碳源是葡萄糖，氮源是尿素2.分析该配方的培养基对微生物是否具有选择作用？如果有，又是如何进行选择的？有筛选作用。尿素是培养基中的唯一氮源，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。阅读22页本课题使用的培养基配方（二）微生物计数1、显微镜直接计数法1mm每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。1mm下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数是多少?1ml菌液中的总菌数?(1ml=1cm3=1000mm3）

5AB×1045A缺点：不能区分死菌与活菌1、显微镜直接计数：利用血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。㈡.统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点2、滤膜法

以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例。将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养液基上培养。在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色。可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。（二）微生物计数3、统计菌落数目——稀释涂布平板法酵母菌的菌落特征：菌落形态特征与细菌相似，但比细菌大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，多数不透明

，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落颜色单调，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。（二）微生物计数注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。③为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。④统计的菌落往往比活菌的实际数目低。平板菌落数统计注意事项1、几个菌落粘连一起，只要肉眼能区分，就算几个2、不管菌落大小，只要肉眼看得见，就应该计数；3、菌落数目过多时，可以合理采用样方法。菌落数统计表格（取样0.1mL,稀释倍数106）第1组第2组第3组第4组123456平均每mL样品中活菌数平板组别恰当的稀释度、正确的涂布操作是成功地统计菌落数目的关键。思考1：如何根据平板上的菌落数推测出每mL样品中的菌株数？

统计某一稀释度下平板上的菌落数，计算出平板上的菌落数的平均值，然后按公式每mL样品中的菌株数=（C÷V）×M进行计算。C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V：涂布平板时所用的稀释液的体积M：稀释倍数思考2：统计的菌落数往往比活菌的际数目高还是低，为什么？

低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。思考3：为了增强实验结果的说服力和准确性，我们在实验设计时应该怎么做更合理？

实例分析1

第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是其中1个平板的计数结果与另外2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。

实例启示1、在实验设计时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力和准确性。2、在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。（三）实验基本原则1、平行重复原则实例分析2想一想：A同学和其他同学所得实验结果差异如此之大，请分析原因可能有哪些？①②实例分析2想一想：你能通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？一种方案：可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验。如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。实例分析想一想：你能通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？另一种方案：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的！

实例启示设置对照实验的目的是什么？

排除实验操作、培养条件等无关变量对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。（三）实验基本原则1、平行重复原则2、对照原则3、单一变量原则设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。㈢.设置对照：设置对照的方法：空白对照：不给对照组任何处理因素。条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素。自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。

A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误。实验名称：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验原理：实验目的：材料用具：实验步骤：1、分组编号

2、处理（遵循实验设计的基本原则）对照原则、单一变量原则（等量原则）科学性原则、平行重复原则可行性原则

3、观察记录（设计观察记录表）实验预期：实验结果的分析与评价：实验结论：设计时请利用P23-P24的三个资料资料一.土壤取样

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中，充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。资料

二.样品的稀释

由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？

答：这是因为土壤中各类微生物的数量是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。思考题

将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。

以表格的形式记录选择培养基中不同菌落的特征。

资料三.微生物的培养与观察

[一]无菌操作1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。[二]做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。[三]规划时间1、结