(第六章)第七章植物的胚培养和体外受精

第八章植物的胚培养和体外受精第一节植物的胚培养第二节植物的离体授粉与受精第三节植物的胚培养实例第一节植物的胚培养一、植物胚培养的含义二、植物胚培养的种类三、植物胚培养的应用四、植物胚培养技术第一节植物的胚培养一、植物胚培养的含义植物的胚培养（embryoidculture）：（狭义上）是指在无菌条件下，把植物的未成熟胚或成熟胚离体接种在特定培养基上进行的培养。从广义上，胚培养还应包括含有胚的胚珠和子房培养以及与胚生长发育有关的胚乳培养在内。第一节植物的胚培养二、植物胚培养的种类根据不同培养目的、培养材料的来源及部位分为4类：1、胚培养（狭义上）（1）成熟胚培养：指子叶已形成的种胚，仅提供一定温度、湿度就可以发芽长成植物体。如种子发芽。对成熟种子的胚进行培养，诱导愈伤组织用作突变体诱导材料和转基因受体材料等。（2）未成熟（幼胚）培养：胚龄处于原胚期、球型期、心型期、早鱼雷期的幼胚的培养。这几个时期幼胚从生理至形态均未成熟，提供一定温度和湿度的不能发芽。主要对远缘杂种幼胚，“胚胎挽救”（embryorescue），以得到远缘杂种植株。第一节植物的胚培养2、胚珠培养：对象：（1）对发育早期（心形期或更早期）难分离的幼胚。（2）对成熟胚非常小的植物，如兰科植物、显花植物的寄生种和某些腐生种。第一节植物的胚培养3、子房培养：（1）授粉（受精）子房培养：对远缘杂交，使胚胎继续生长发育。如对水稻远缘杂交（野×栽）的胚胎早期败育。（2）未授粉（未受精）子房培养： 用于固定杂种优势的研究。如对水稻无融合生殖与杂种优势固定研究。第一节植物的胚培养4、胚乳培养：（1）成熟胚乳培养；（2）未成熟胚乳培养胚乳为特殊组织，影响胚生长发育，遗传组成独特。被子植物胚乳为三倍体，培养目的为产生三倍体植株；裸子植物胚乳为单倍体，经培养可得单倍体植株。第一节植物的胚培养5、试管受精（离体受精）：从花粉萌发到受精形成种子，从种子萌发到幼苗形成的整个过程，均在试管内完成，称试管受精或离体受精。指培养未受精的胚珠并在试管内撒播花粉，使其受精形成具有生活力的种子。第一节植物的胚培养三、植物胚培养的应用1、在远缘杂交中克服杂种不育；2、克服自交种子不育或生活力低；3、克服种子休眠，促进种子发芽；4、产生单倍体、三倍体植株；5、繁殖稀有植物；6、使胚发育不全的植物获得大量后代；7、克服核果类胚的后熟作用；8、用于种子生活力的快速测定；9、用于无融合生殖和杂种优势固定；10、用于突变体诱变和转基因研究。第一节植物的胚培养1、在远缘杂交中克服杂种不育在远缘杂交中，往往由于胚发育不全而败育或胚不能萌发等使远缘杂交不能成功，如果将这类胚在适当时期取出（或利用其胚珠、子房），在合适培养基上进行培养，可使胚正常生长而获得杂种植株。第一节植物的胚培养2、克服自交种子不育或生活力低长期营养繁殖的植物，具有形成种子的能力，但它们的种子常是无生活力的，如芭蕉属有许多结籽品种在自然情况下种胚不萌发。杂交育种中以某些种的早熟种为母本而获得的杂种，种子生活力低下，甚至经过冷藏处理也不能萌芽。第一节植物的胚培养3、克服种子休眠，促进种子发芽打破种子休眠情况有2种：（1）种胚发育不全；（2）抑制物质抑制种胚发芽。不少植物的种子休眠期很长，不利于植物有性繁殖和育种工作。通过离体胚培养可大大缩短其休眠期。如：一种苹果（Weepingcrabapple<Malussp.>）的种子在土中需经9个月才能萌发。经离体胚培养后，48小时内便开始萌发，4周内形成可移栽的幼苗。至第5个月，苗高达1米。第一节植物的胚培养4、产生单倍体、三倍体植株

胚培养技术的一种新的应用是用于通过远缘杂交定向的消除染色体而产生单倍体。即：在胚发生的最初几次细胞分裂期间，染色体优先地被排除而消失。结果形成了单倍体胚，呈现缓慢的生长。但往往在受精后2～5天，出现胚乳解体，因此，需要通过培养其离体胚才能产生单倍体植株。经染色体加倍后，便能生产出纯系的植株。对胚乳（三倍体）的培养，即可得到三倍体植株。第一节植物的胚培养5、繁殖稀有植物有些稀有植物的种子在自然界里不能萌发，但经胚培养可容易地获得幼苗。第一节植物的胚培养6、使胚发育不全的植物获得大量后代一些寄生植物或腐生植物，如兰花、天麻等，在种子成熟时，（由于）种子里包含着未分化的胚，有的胚只有6～7个细胞，即处于原胚阶段，故种子成熟后，由于胚乳不发育（不良），胚不能获得所需的营养物质，大多数的胚不能成活。倘若在果实达八成成熟度时，将胚分离出来培养，便能继续生长，发育成正常植株。第一节植物的胚培养7、克服核果类胚的后熟作用在核果类植物的早熟品种育种工作中，常遇到一个辣手的问题就是果实的早熟性往往伴随产生无生活力的种子。故早熟品种用一般种子繁殖法很难获得杂种后代。采用离体幼胚培养法便可获得杂种后代。第一节植物的胚培养8、用于种子生活力的快速测定离体胚培养是一种比常规用的种子活力染色法更为可靠和精确的方法（Barton,1961）。测定休眠后的种子生活力，应用一般的种子萌发试验需很长时间，特别是木本植物需要层积处理打破休眠。第一节植物的胚培养9、用于无融合生殖和杂种优势固定通过对子房、幼胚等培养，获得无融合生殖的成熟种胚及后代植株。通过胚珠培养获得“多胚苗”，“固定”杂种优势。第一节植物的胚培养10、用于突变体诱变和转基因研究因为成熟种子可以贮用，所以进行成熟种胚培养时可以不受季节、气候、环境等外界条件的限制，也不易受微生物的侵染（因有种壳、种皮在外保护），取材方便，易于消毒灭菌和接种培养，培养效率高。利于同步获得大量和均一的愈伤组织或胚性细胞团，作为突变体诱变的供体材料和转外源基因的受体材料。第一节植物的胚培养四、植物胚培养技术1、离体胚培养技术2、胚珠培养技术3、子房培养技术4、胚乳培养技术第一节植物的胚培养1、离体胚培养技术（1）成熟胚培养技术（2）未成熟胚（幼胚）培养技术2、胚珠培养技术3、子房培养技术（1）授粉（受精）子房培养技术（2）未授粉（未受精）子房培养技术4、胚乳培养技术（1）成熟胚乳培养技术（2）未成熟胚乳培养技术第一节植物的胚培养1、离体胚培养技术（1）选取材料（2）材料灭菌（3）胚的剥离（4）胚培养基（5）培养条件第一节植物的胚培养（1）选取材料选材要求：一是胚容易节离；二是数量多，而且遗传上和发育时期均较一致。对种间或属间杂交（远缘杂交）的幼胚进行培养，要选择合适的胚龄，胚龄太小胚培养不易存活，胚龄太大胚可能已改育或死亡。不同植物胚培养对胚龄有不同要求。原则：必须在胚开始败育之前切离胚供培养。第一节植物的胚培养（2）材料灭菌在剥离胚之前，根据所用材料之不同，对整个种子、子房或胚珠甚至整个未成熟的果实按常规灭菌方法作表面灭菌。（3）胚的剥离合子胚由于发育程度不同分有成熟胚和未成熟胚。不同植物间合子胚的大小也有很大差别。因此剥离合子胚的难易程度有所不同。通常成熟胚和体积较大的容易剥离，未成熟胚和体积小的胚难剥离。第一节植物的胚培养剥离胚时须根据种子的结构和胚的大小与剥离的难易等不同采用不同的无菌器械，如解剖针或接种针、尖头镊子和具柄解剖刀等。体积小的胚还须借助体视显微镜（90X），使用冷光源。剥离胚时，不管是成熟胚或未成熟胚，均需小心操作，切莫伤害胚及其胚柄。第一节植物的胚培养（4）胚培养基培养基的组成是胚培养成败的最关键条件。合适的培养基能够使离体胚渐进地、有序地按其固有的发育期正常发育至成熟并萌发长成植株。对成熟胚来说，只需在含有无机盐和糖的培养基上就能正常生长成幼苗。但对未成熟的幼胚（子叶期以前的各期胚结构）来说，对培养基的要求就比较复杂，对所用培养基可从下面几个方面考虑：第一节植物的胚培养①基本培养基：可用MS、White、Tukey、Norstog等。②糖类：常用蔗糖，它是离体的成熟胚和未成熟胚培养所必需的最合适的糖。一般使用浓度为2%左右。第一节植物的胚培养③氨基酸和维生素：培养基中加入合适的氨基酸等有机氮化合物，可以明显改善幼胚生长状况。Hanning(1904)发现精氨酸有效地促进胚的生长。Rijven（1955）发现谷氨酰胺能促进9种不同科的有花植物胚的生长，其促进效果比精氨酸好得多。对植物离体胚的生长来说，就单种氨基酸而言，谷氨酰胺是最有效的。酪蛋白水解物（CH）是一种氨基酸复合物，广泛地被用作胚培养基的附加物。一般使用浓度为400～500mg·L-1。第一节植物的胚培养可供胚培养用的维生素有硫胺素、呲哆醇、烟酸、生物素、肌醇等。对于已成熟的发育完全的胚来说，维生素并非必需，但对未成熟的幼胚来说，某些维生素是必需的。因此，培养某种离体胚时，是否需要维生素，需要哪种维生素，应通过试验性的试验来确定。第一节植物的胚培养④天然的提取物：由于胚在植物体内是靠其胚乳滋养的，因此在幼胚培养中，人们就自然地应用一些植物胚乳或其提取物作为培养基的成分。（前已提及，李继桐和沈同（1934）发现银杏胚乳提取物对培养的银杏胚生长有促进作用。又如，加入非热压灭菌的椰子乳（CM），对幼胚培养有很好的效果。）第一节植物的胚培养⑤植物生长调节剂：离体培养的成熟胚通常是不需要外源生长调节剂的。Monnier（1978）指出，胚培养基中加入生长调节剂，会引起胚结构异常。他认为胚对大多数生长调节剂是自给的。但也有不少报道认为加入适量的植物生长调节剂，对刺激胚（特别是幼胚）的生长发育和萌发有促进作用。常用的植物生长调节剂有：IAA、KT、ABA、GA3（对处于休眠期的胚有很好的破除休眠的作用）和2.4-D、NAA（用于诱导胚生长的同时诱导愈伤组织）。不同植物和不同胚发育时期对激素的需要和反应是不同的。通常低浓度的激素对胚生长有利，高浓度则否。特别是生长素，容易诱导胚产生愈伤组织。第一节植物的胚培养⑥培养基的pH：培养基的pH值对幼胚的生长与发育有明显影响。不同种类的植物或不同发育（时）期的幼胚对pH值要求不同。一般要求pH值在5～7。第一节植物的胚培养（5）培养条件：①温度：对大多数植物来说，胚培养所要求的合适温度为25～30℃。但不同植物的胚对温度要求也有很大差别。例如，水稻胚培养适温为30℃，棉花幼胚为32℃。但有些植物幼胚培养要求低温。如：马铃薯胚培养在20℃时生长最好。百合胚培养需要17℃，为打破其休眠，尚需4℃冷处理。第一节植物的胚培养②光照条件：由于胚在母体植株上被包埋在胚珠内，因此，认为胚培养时对光照无特别要求。一般认为培养在光照12小时黑暗12小时的光周期下对胚芽生长较好，但对根生长有抑制。光照强度一般以2000Lx为宜。先黑暗中培养7～14天，再移至光下培养。第一节植物的胚培养2、胚乳培养技术（1）胚乳发育时期双受精后的胚乳核，先分裂形成游离核。这一时期的胚乳称为“游离核期”。继续发育后形成细胞壁，即形成许多小的细胞。这一时期称为“胚乳细胞期”。“游离核期”的胚乳离体培养很难成功；“细胞期”的胚乳离体培养成功率较高。第一节植物的胚培养（2）胚性因子（Embryofactor）的作用带胚培养，利于形成愈伤组织。（3）培养基酸碱度对胚乳组织培养的影响。第二节植物的离体授粉与受精一、离体受精的概念和意义二、离体受精的方法三、离体受精成功的技术关键第二节植物的离体授粉与受精一、离体受精的概念和意义1、概念从花粉萌发到受精形成种子，从种子萌发到幼苗形成的整个过程，均在试管内完成，称离体受精，体外受精（invitrofertilization），或试管受精（test-tubefertilization）。2、意义：离体受精技术在克服植物受精不育障碍，特别是克服花粉在柱头上不萌发或萌发后花粉管不能伸入花柱，或在花柱中生长缓慢，使配子不能如期融合的障碍有着极其重要的意义。第二节植物的离体授粉与受精二、离体受精的方法将未授粉的子房，经表面灭菌后，取出胚珠，接种在培养基上。然后，在试管内撒播花粉。花粉发芽后，花粉管长入胚珠内受精，受精后的胚珠进一步发育形成种子，种子能在培养基上发芽长成植株。第二节植物的离体授粉与受精离体受精的具体作法：（5种）1、从胎座上切下单个胚珠（裸露胚珠），接种在培养基上，然后撒播花粉的方法。2、带着完整胎座或部分胎座接种并撒播花粉的方法。3、带着完整子房或部分子房壁接种并撒播花粉的方法。由于带着完整子房，对于解央花粉和柱头，花粉管和花柱两种形式的受精障碍不起作用。故发展到切去柱头和花柱直接在子房上散布花粉的作法。如烟草试管受精（Dulieu,1966）第二节植物的离体授粉与受精4、柱头接近法。将花粉撒在本种植物的柱头上，切下柱头接种在培养基上。然后在柱头周围，接种异种裸露胚珠，花粉在本种植物的柱头哺育下发芽，花粉管伸长并进入胚珠受精。这一方法是解决花粉发芽和胚珠培养，在培养基组成上发生矛盾时，所采用的一种方法。5、哺育法。将胚珠表面先蘸满有助于花粉发芽的培养基接种培养，然后在胚珠上撒播花粉使之受精。这一方法是解决胚珠存活率和花粉发芽、花粉管伸长培养基发生矛盾时的作法。第二节植物的离体授粉与受精三、离体受精成功的技术关键1、离体胚珠的成活率和受精力试管受精的成功率与胚珠的成分活率有着密切关系。提高离体胚珠成活率的关键是培养基。因此要对培养基的各种成分进行详细的筛选。诸如基本培养基、激素种类和浓度、渗透压、pH值等。适宜胚珠离体培养而且成活率很高的培养基，往往不能使花粉萌发或不能使萌发后的花粉管伸长。为此需同时筛选有利于花粉萌发和花粉管伸长的培养基。第二节植物的离体授粉与受精2、花粉萌发和花粉管的生长速度试管内撒粉后，如何保证花粉迅速发芽，并且有较高的发芽率；花粉管能迅速伸长并在受精允许的时间内到达胚囊，其关键仍然是培养基。因此需对花粉萌发和花粉管伸长的适宜培养基进行筛选。培养基筛选中要注意钙和硼对促进花粉萌发和花粉管伸长的作用。第二节植物的离体授粉与受精3、花粉的灭菌试管受精是在无菌条件下进行，所以花粉必须先进行灭菌。目前常用的花粉灭菌方法如下：（1）用新鲜花蕾浸渍灭菌，然后剥出花粉使用。由于花粉粘连，撒播不均匀，因而影响撒播质量。如若待药囊自行裂开后再用，但又不能保证花粉具有高的萌发率和受精力（率）。（2）紫外线照射灭菌，照射时间约15min，但灭菌效果和受精率有一定的矛盾，因此要在灭菌率、发芽率、受精率三者之间筛选最适宜的照射时间。第二节植物的离体授粉与受精4、鉴别受精的标记性状试管内的胚珠撒播花粉后，如何辨别受精与否呢？那就需要标记性状。玉米“胚乳直感”现象，是试管受精的优良标记性状。白色胚乳（♀）×紫色胚乳（♂）↓

F1代（胚乳紫色）第三节植物的胚培养实例一、水稻野栽杂交及胚胎培养研究国际水稻研究所植物育种与遗传生化系IRRI(InternationalRiceResearchInstitute)PBGBDivision(PlantBreedingandGeneticBiochemistryDivision)Dr.G.S.Khush;Dr.Bra