上游顺式作用元件的研究方法

上游顺式作用元件的研究方法

mega顺式作用元件（Cis-actingelements）指同一DNA分子中具有转录调节功能的特异DNA序列，即具有特殊功能的转录因子DNA结合位点和其他调控基序。顺式作用元件能够被特异转录因子识别和结合，从而影响基因表达活性。顺式作用元件的作用是参与基因表达的调控，本身不编码任何蛋白质,仅仅提供一个作用位点,要与反式作用因子相互作用而起作用。

按功能特性分为通用调节元件：启动子、增强子、沉默子和绝缘子专一性元件：应答元件，如激素应答元件等启动子(Promoter)概念：启动子是基因序列中决定转录起始的部位。包括核心启动子和上游启动子元件。一个基因可同时拥有一个及以上启动子；一般在转录起始点上游，位于5‘端上游100-200bp左右，是决定转录起始点及转录频率的关键元素；可与增强子共同控制转录起始和强度；发挥功能时需RNA聚合酶外，还需转录调控因子与启动子区各种调控元件相互作用。由两部分组成：核心启动子（CPE)：指保证RNApolⅡ转录正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游-25—-30bp的TATA盒。它单独起作用时，只能确定转录起始位点并产生基础水平的转录；上游启动子元件（UPE)：包括通常位于-70bp附近的CAAT盒、GC盒等，能通过TFⅡD复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。增强子(enhancer)

指能够提高转录效率、远距离调控基因转录的上游DNA序列,它间接的把信号从激活因子传到转录蛋白。特点：（1）它能通过启动子大幅度地增加同一条DNA链上靶基因转录的频率，一般能增加10～200倍，有的甚至可达千倍。（2）增强子的作用对同源或异源的基因同样有效，如把SV40的增强子连接到兔β-珠蛋白的基因上，可使转录强度增大100倍；（3）增强子的位置可在基因5’上游、基因内或其3’下游的序列中，增强效益与其位置和取向无关；（4）增强子所含核苷酸序列大多为重复序列，其内部含有的核心序列，对于它进入到另一宿主之后重新产生增强子效应至关重要；（5）增强子一般都具有组织和细胞特异性；（6）增强子在DNA双链中没有5’与3’固定的方向性；（7）增强子可远离转录起始点，通常在1～4kb（个别情况可达30kb）外起作用；（8）增强子的活性与其在DNA双螺旋结构中的空间方向性有关。另外，许多增强子还受到外部信号的调控，如金属硫蛋白基因的增强子就可对环境中的锌、镉浓度作出反应。从机能上讲，没有增强子存在，启动子通常不能表现活性；没有启动子时，增强子也无法发挥作用。有时，对结构密切联系而无法区分的启动子、增强子样结构统称启动子。通常描述的、具有独立的转录活性和决定基因时间、空间特异性表达能力的启动子就是这类定义的启动子。沉默子(silencer)

是可以抑制基因表达的顺式元件,包括沉默子元件和负调控因子(NRE),分别指导主动和被动抑制作用。特点：负性调节元件，与增强子作用相反不受序列方向影响，同时也能远距离发挥作用本身不能实现衰减作用，必须通过对前导序列的翻译才能实现，衰减作用的实质是以翻译手段控制基因的转录。绝缘子（Insulator）一种负调控元件，参与基因表达的负调控。干扰增强子与启动子的相互作用，并抑制启动子的激活活性。应答元件另一类位于基因上游能被转录因子识别和结合,调控基因专一性表达的DNA序列。如热激应答元件、激素应答元件,cAMP应答元件等。应答元件含有短重复序列,不同基因中应答元件的拷贝数相近。蛋白因子结合在应答元件的保守序列上,通常位于转录起点上游200bp内；应答元件也有位于启动子或增强子内。研究顺式作用元件结构的方法①5’端缺失系列分析法

通过从一侧逐段缺失来确定启动子的边界.当一段缺失不会阻碍RNA合成,而下一段缺失使转录不再发生时,那么我们可以确定启动子的边界必然存在于两者之间.

常用于测定哺乳动物基因调控区的上游边界。爪蟾5SrRNA基因的Ⅲ类启动子分析实验操作：首先，确定启动子的5’端。对爪蟾5SrRNA基因的5’端序列进行逐渐缺失，每次缺失序列的长度都会增长，有此获得5’端长度不等的系列5SrRNA基因突变体，体外观察突变对基因转录的影响。通过凝胶电泳测定转录产物的大小，依次判断转录的正确与否。该基因的正常转录产物长度为120bp。泳道a：未发生序列缺失的阳性对照泳道b-j：序列缺失后的基因泳道k：阴性对照（pBR322DNA，无

5SrRNA基因序列）5’-序列缺失对5SrRNA基因转录的影响

②接头扫描突变法

可以找出存在于基因转录起始位点和5’端边界之间的所有调控元件方法的基础是构建一系列序列重叠的调控区突变体，每个突变体内各有一个短序列的核苷酸序列被打乱然后分别转染培养细胞，或微量注入爪蟾卵母细胞，并分析它们对报告基因的影响接头扫描突变法机制对疱疹病毒的胸苷激酶基因启动子的研究方法：用长度为10bp的接头对胸苷激酶基因启动子序列进行系统替换，产生不同的突变体，然后将突变DNA分子注入蛙暖母细胞，同时也注入类似野生型的DNA（在+21至+31处发生突变），这种野生型突变启动子与正常野生型启动子一样，具有正常的起始转录活性，可作为内参。最后，通过凝胶电泳测定转录产物的大小，